作者relaxsleep (火球連發~)
看板Biotech
標題[求救] pichia pastoris X-33 transformation
時間Wed Mar 3 13:00:33 2010
請問各位
我目前在做pPICZaC分別插入三段片段 轉殖到P. pastoris X-33
先使用PmeI去切線性質體(需要clean up嗎?)
升任細胞製作是培養3ml YPD overnight 30度 250rpm
在隔天取100ul接種到100ml YPD約八小時長到OD600 1.3~1.5 (時間會不會太短?)
6000rpm離心去培養基
冰無菌水100ml重新懸浮5000 rpm離心
在使用50ml無菌水+4ml 1M sorbitol懸浮 5000rpm離心
在使用20ml 1M sorbitol懸浮 5000rpm離心
最後用200ul 1M sorbitol回溶得到勝任細胞
再把切好的質體10ul+80ul勝任細胞混勻 冰上5分鐘
1500V 15uF 335電阻 電擊
加入1ml 1M sorbitol放30度1.5小時
塗YPDS plate 100ug/ml Zeocin
養兩天挑菌
抽genomic DNA
用5'AOX1 3'AOX1 primer PCR
95度4 min 1cycle; 94 60sec, 55 60sec, 72 150sec 34cycle; 72 10min 1 cycle
結果都只有P到菌體本身的AOX1 gene沒有轉入的基因
請問哪裡有問題
有研究的大大 幫忙指證一下 謝謝!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.106
※ 編輯: relaxsleep 來自: 140.129.35.106 (03/03 13:01)
1F：→ BarryJones:建議以更高濃度的Zeocin進行篩菌~並將同一菌落點在不同 03/03 15:19
2F：→ BarryJones:抗性的Zeocin上~選擇高抗性又長得大顆的菌株~以少量 03/03 15:20
3F：→ BarryJones:誘導的方式判斷哪一個菌株會產生你要的蛋白質~ 03/03 15:21
4F：→ BarryJones:基本上以PCR方式確定~也行~但我之前也有發生P不到的事~ 03/03 15:23
5F：→ relaxsleep:濃度是依照invitrogen protocal建議用100的 03/03 16:51
6F：→ relaxsleep:p不到不就代表沒送進去喔? 誘導的話後續步驟感覺蠻繁 03/03 16:53
7F：→ relaxsleep:雜的 不知道有沒有快速篩選的方法 不然沒送進去誘導也 03/03 16:53
8F：→ relaxsleep:是白做的感覺@@" 03/03 16:54
9F：→ BarryJones:對~但是你可以增高抗生素濃度做進一步的篩選~提高選中 03/03 19:27
10F：→ BarryJones:機率 03/03 19:27
11F：→ BarryJones:但我曾經有做過P不到但誘導得出來的事~而且誘導得出來 03/03 19:28
12F：→ BarryJones:才是重點阿! 03/03 19:28
13F：→ BarryJones:不然你可以篩選高抗性的菌株再進一步去PCRㄝ行~ 03/03 19:30
14F：→ qumai:還是先誘導看看吧 有時候不一定P得出來 但是可以表現蛋白質 03/03 19:40
15F：→ qumai:培養幾mL就夠了 如果擔心看不到的話 先做蛋白質沉澱再跑膠 03/03 19:43
16F：→ relaxsleep:恩 謝謝 我有試過2000的 幾乎都會長 但是還是p不到@@ 03/03 21:04
17F：推 littlelizard:切完的質體要 clean up 我們都是先挑 300隻 03/05 15:36
18F：→ littlelizard:然後再挑到5X抗性的plate 之後你可以選擇用試管小量 03/05 15:36
19F：→ littlelizard:誘導然後跑PAGE 或者用 96孔盤養菌然後用ELISA篩菌 03/05 15:37
20F：→ littlelizard:如果都做不出來可以分析一下 codon usage 最近發現很 03/05 15:38
21F：→ littlelizard:多表現量很差都是跟 codon usage 有關 = = 03/05 15:38
22F：→ relaxsleep:可以請問96孔盤養菌然後用ELISA篩菌的方法嗎 我沒用過 03/06 13:40
23F：→ relaxsleep:這方法@@ 03/06 13:40
24F：推 littlelizard:我們家很少在抽 genome 除非你要做 copy number 啦 03/10 21:09