作者relaxsleep (火球连发~)
看板Biotech
标题[求救] pichia pastoris X-33 transformation
时间Wed Mar 3 13:00:33 2010
请问各位
我目前在做pPICZaC分别插入三段片段 转殖到P. pastoris X-33
先使用PmeI去切线性质体(需要clean up吗?)
升任细胞制作是培养3ml YPD overnight 30度 250rpm
在隔天取100ul接种到100ml YPD约八小时长到OD600 1.3~1.5 (时间会不会太短?)
6000rpm离心去培养基
冰无菌水100ml重新悬浮5000 rpm离心
在使用50ml无菌水+4ml 1M sorbitol悬浮 5000rpm离心
在使用20ml 1M sorbitol悬浮 5000rpm离心
最後用200ul 1M sorbitol回溶得到胜任细胞
再把切好的质体10ul+80ul胜任细胞混匀 冰上5分钟
1500V 15uF 335电阻 电击
加入1ml 1M sorbitol放30度1.5小时
涂YPDS plate 100ug/ml Zeocin
养两天挑菌
抽genomic DNA
用5'AOX1 3'AOX1 primer PCR
95度4 min 1cycle; 94 60sec, 55 60sec, 72 150sec 34cycle; 72 10min 1 cycle
结果都只有P到菌体本身的AOX1 gene没有转入的基因
请问哪里有问题
有研究的大大 帮忙指证一下 谢谢!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.106
※ 编辑: relaxsleep 来自: 140.129.35.106 (03/03 13:01)
1F：→ BarryJones:建议以更高浓度的Zeocin进行筛菌~并将同一菌落点在不同 03/03 15:19
2F：→ BarryJones:抗性的Zeocin上~选择高抗性又长得大颗的菌株~以少量 03/03 15:20
3F：→ BarryJones:诱导的方式判断哪一个菌株会产生你要的蛋白质~ 03/03 15:21
4F：→ BarryJones:基本上以PCR方式确定~也行~但我之前也有发生P不到的事~ 03/03 15:23
5F：→ relaxsleep:浓度是依照invitrogen protocal建议用100的 03/03 16:51
6F：→ relaxsleep:p不到不就代表没送进去喔? 诱导的话後续步骤感觉蛮繁 03/03 16:53
7F：→ relaxsleep:杂的 不知道有没有快速筛选的方法 不然没送进去诱导也 03/03 16:53
8F：→ relaxsleep:是白做的感觉@@" 03/03 16:54
9F：→ BarryJones:对~但是你可以增高抗生素浓度做进一步的筛选~提高选中 03/03 19:27
10F：→ BarryJones:机率 03/03 19:27
11F：→ BarryJones:但我曾经有做过P不到但诱导得出来的事~而且诱导得出来 03/03 19:28
12F：→ BarryJones:才是重点阿! 03/03 19:28
13F：→ BarryJones:不然你可以筛选高抗性的菌株再进一步去PCRㄝ行~ 03/03 19:30
14F：→ qumai:还是先诱导看看吧 有时候不一定P得出来 但是可以表现蛋白质 03/03 19:40
15F：→ qumai:培养几mL就够了 如果担心看不到的话 先做蛋白质沉淀再跑胶 03/03 19:43
16F：→ relaxsleep:恩 谢谢 我有试过2000的 几乎都会长 但是还是p不到@@ 03/03 21:04
17F：推 littlelizard:切完的质体要 clean up 我们都是先挑 300只 03/05 15:36
18F：→ littlelizard:然後再挑到5X抗性的plate 之後你可以选择用试管小量 03/05 15:36
19F：→ littlelizard:诱导然後跑PAGE 或者用 96孔盘养菌然後用ELISA筛菌 03/05 15:37
20F：→ littlelizard:如果都做不出来可以分析一下 codon usage 最近发现很 03/05 15:38
21F：→ littlelizard:多表现量很差都是跟 codon usage 有关 = = 03/05 15:38
22F：→ relaxsleep:可以请问96孔盘养菌然後用ELISA筛菌的方法吗 我没用过 03/06 13:40
23F：→ relaxsleep:这方法@@ 03/06 13:40
24F：推 littlelizard:我们家很少在抽 genome 除非你要做 copy number 啦 03/10 21:09