作者hshinyi (DAN)
看板Biotech
標題[求救]PCR做不出來(已爬文)
時間Mon Feb 22 23:54:07 2010
大家好,我想要求救,因為我PCR怎樣都出不來快被老闆追殺了。。。
因為想show一些圖和條件給大家參考,所以有把目前幾次PCR結果貼在網誌上
網誌圖文版:
http://hshinyi.pixnet.net/blog/post/24927108
希望大家能給我一點意見。
---------------------以下全都從網誌來的 只有文字沒有圖-------------------------
我先前有去NCBI做electronic PCR
測試設計的primer專一性
至少目前看起來這對Primer確實可以夾出我要的geneX,
而且專一性高,在genome database裡沒有其他hit。
在genome上的這段序列是high GC content
所以gradient PCR中間的annealing step 我用比較高的溫度
結果失敗。沒有東西。
然後我又另外加了betaine(5M) 1 uL
DMSO濃度不變 只有1％
Gradient PCR範圍拉大 從55～67度
結果只有前面大約55～58左右有PCR產物出現
可是卻沒有我要的PCR產物 (大小約463bp)
後來我突然想到來PTT找看看有沒有人有這問題
搜尋文章後發現先前有人建議
若GC比例高(60~70%) DMSO濃度可以升高到7.5～10％
然後我就試了這個條件
結果還是失敗 整塊膠超乾淨的 只看到marker跑的超漂亮...=___=" （救命啊～）
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* 最亮那條marker是500bp
* PCR program:
1. 95'c, 10min
2. 95'c, 45sec
55~67'c, 1min
72'c, 30sec
(29cycles)
3. 72'c, 10min
4. 4'c, 10min
*Taq和dNTP還有Genomic DNA理論上都沒有壞
因為跑其他組Primer都沒有問題。
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如果有人可以給我建議
請問我現在應該更改什麼條件會比較好？
改DMSO濃度？
改Betaine濃度？
改PCR條件？
拜託各位幫忙了～ 謝謝。
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.118.180
1F：推 jademan:cycle=29 不覺得太短嗎? 不如cycle內時間短些,cycle數長些 02/23 11:26
2F：推 kirby0415:DNA 1ul的濃度是多少? 02/23 11:51
3F：→ hshinyi:genomic DNA濃度約50ng/uL 02/23 11:52
4F：推 nixo:用什麼酵素？ 02/23 12:25
5F：推 yaliu:第一個step為什麼要設到95度10分鐘?很長耶這個時間 02/23 12:33
6F：→ yaliu:應該94度5分鐘就夠了吧...denature我只設94~貌似有聽過太高 02/23 12:35
7F：→ yaliu:溫會加速Taq半衰期之類的.... 02/23 12:35
8F：→ hshinyi:酵素是Fermentas的Dream Taq 02/23 12:39
9F：推 conective:總體積作20μL 第一個step 94度 5分鐘 試試看 02/23 13:56
10F：→ conective:DMSO 5% 02/23 13:56
11F：→ hshinyi:樓上,那要加betaine嗎? 02/23 21:55
12F：推 lulusa:以你的長度95度不需要那麼久 dntp看起來有點少 02/23 23:56
13F：推 lulusa:annealing的溫度可以從50度開始試 先有主band再說 02/23 23:58
14F：→ lulusa:有主band出現 再來調鎂離子濃度(一開始的鎂要用最低去試) 02/24 00:00
15F：推 nixo:建議換專為高GC狀況使用的酵素，和其他實驗室借或索取樣品 02/24 03:44
16F：推 icome:finnzyme的phusion DNA pol有GC-rich專用的buffer 可試試 02/24 09:43
17F：→ hshinyi:我使用的Buffer裡面已經有含Mg 不需要外加耶... 02/24 11:09
18F：推 gerpy:betain可以試著再增加到反應濃度為1-1.5M間。 02/24 17:05
19F：→ gerpy:betaine 02/24 17:06
20F：→ solomo:可以同時試看看其他酵素 KAPA ROBUST 02/24 20:22
21F：推 licat:我會試兩三種不同家的酵素 annealing溫度降低到50 02/24 21:27
22F：→ licat:出不來的話直接重新設計一對primer 不要與上一對的座落位置 02/24 21:28
23F：→ licat:有重疊到 然後再跑PCR... 加油～ 02/24 21:29
24F：推 rivor:好像我同學做的耶...是昆X嗎..呵 02/26 10:46
25F：→ hshinyi:樓上 我想我不是你同學耶... 03/02 01:30