作者hshinyi (DAN)
看板Biotech
标题[求救]PCR做不出来(已爬文)
时间Mon Feb 22 23:54:07 2010
大家好,我想要求救,因为我PCR怎样都出不来快被老板追杀了。。。
因为想show一些图和条件给大家参考,所以有把目前几次PCR结果贴在网志上
网志图文版:
http://hshinyi.pixnet.net/blog/post/24927108
希望大家能给我一点意见。
---------------------以下全都从网志来的 只有文字没有图-------------------------
我先前有去NCBI做electronic PCR
测试设计的primer专一性
至少目前看起来这对Primer确实可以夹出我要的geneX,
而且专一性高,在genome database里没有其他hit。
在genome上的这段序列是high GC content
所以gradient PCR中间的annealing step 我用比较高的温度
结果失败。没有东西。
然後我又另外加了betaine(5M) 1 uL
DMSO浓度不变 只有1％
Gradient PCR范围拉大 从55～67度
结果只有前面大约55～58左右有PCR产物出现
可是却没有我要的PCR产物 (大小约463bp)
後来我突然想到来PTT找看看有没有人有这问题
搜寻文章後发现先前有人建议
若GC比例高(60~70%) DMSO浓度可以升高到7.5～10％
然後我就试了这个条件
结果还是失败 整块胶超乾净的 只看到marker跑的超漂亮...=___=" （救命啊～）
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* 最亮那条marker是500bp
* PCR program:
1. 95'c, 10min
2. 95'c, 45sec
55~67'c, 1min
72'c, 30sec
(29cycles)
3. 72'c, 10min
4. 4'c, 10min
*Taq和dNTP还有Genomic DNA理论上都没有坏
因为跑其他组Primer都没有问题。
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如果有人可以给我建议
请问我现在应该更改什麽条件会比较好？
改DMSO浓度？
改Betaine浓度？
改PCR条件？
拜托各位帮忙了～ 谢谢。
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.118.180
1F：推 jademan:cycle=29 不觉得太短吗? 不如cycle内时间短些,cycle数长些 02/23 11:26
2F：推 kirby0415:DNA 1ul的浓度是多少? 02/23 11:51
3F：→ hshinyi:genomic DNA浓度约50ng/uL 02/23 11:52
4F：推 nixo:用什麽酵素？ 02/23 12:25
5F：推 yaliu:第一个step为什麽要设到95度10分钟?很长耶这个时间 02/23 12:33
6F：→ yaliu:应该94度5分钟就够了吧...denature我只设94~貌似有听过太高 02/23 12:35
7F：→ yaliu:温会加速Taq半衰期之类的.... 02/23 12:35
8F：→ hshinyi:酵素是Fermentas的Dream Taq 02/23 12:39
9F：推 conective:总体积作20μL 第一个step 94度 5分钟 试试看 02/23 13:56
10F：→ conective:DMSO 5% 02/23 13:56
11F：→ hshinyi:楼上,那要加betaine吗? 02/23 21:55
12F：推 lulusa:以你的长度95度不需要那麽久 dntp看起来有点少 02/23 23:56
13F：推 lulusa:annealing的温度可以从50度开始试 先有主band再说 02/23 23:58
14F：→ lulusa:有主band出现 再来调镁离子浓度(一开始的镁要用最低去试) 02/24 00:00
15F：推 nixo:建议换专为高GC状况使用的酵素，和其他实验室借或索取样品 02/24 03:44
16F：推 icome:finnzyme的phusion DNA pol有GC-rich专用的buffer 可试试 02/24 09:43
17F：→ hshinyi:我使用的Buffer里面已经有含Mg 不需要外加耶... 02/24 11:09
18F：推 gerpy:betain可以试着再增加到反应浓度为1-1.5M间。 02/24 17:05
19F：→ gerpy:betaine 02/24 17:06
20F：→ solomo:可以同时试看看其他酵素 KAPA ROBUST 02/24 20:22
21F：推 licat:我会试两三种不同家的酵素 annealing温度降低到50 02/24 21:27
22F：→ licat:出不来的话直接重新设计一对primer 不要与上一对的座落位置 02/24 21:28
23F：→ licat:有重叠到 然後再跑PCR... 加油～ 02/24 21:29
24F：推 rivor:好像我同学做的耶...是昆X吗..呵 02/26 10:46
25F：→ hshinyi:楼上 我想我不是你同学耶... 03/02 01:30