作者lancerjojo (JOJO)
看板Biotech
標題[求救] phospho p38 的western blot
時間Sat Feb 6 14:35:19 2010
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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各位板上的前輩們
小弟最近在壓phospho p38的western blot
用的一抗是cell signaling的一抗
二抗則是millipore的goat anti-rabbit IGg
但是壓出來的東西實在是不能看
在重要的位置都會出現黑色的背景
中間的部份會比較乾淨
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如上圖，以中間圓圈為中心往外是乾淨的
但是越到外圍越黑
我一抗後是以TBST wash 3次 每次10分鐘
二抗則是以TBST wash 6次 每次10分中
以shaker搖晃約125 rpm
這是第一個狀況
第二個狀況是
一條lane中出現其他的band
理論上來說是不應該出現的
本來我一抗的時間是4度C O/N 但是發現會洗不乾淨之後改室溫 1hr
(還是很髒就是了)
二抗則是室溫 1HR 後來改30min
一抗的濃度為1:1000
二抗則為1:5000
我試過二抗用1:10000
但是卻還是會在外圍的地方背景較黑
不過有明顯變的比較乾淨
但是與中間比起來較為黑
不知道請問我該如何解決呢?
我已經壓了一個月了............
謝謝各位大德
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.93.162
1F：推 tsubasawolfy:datasheet不是寫4度C O/N? 02/06 14:47
2F：→ lancerjojo:樓上的大大~ 我本來就是用4度C O/N 不過還是會髒 也會 02/06 15:00
3F：→ lancerjojo:出現多條BAND 02/06 15:00
※ 編輯: lancerjojo 來自: 192.192.93.162 (02/06 15:03)
4F：推 celestial318:blocking用BSA試試? 02/06 23:36
5F：推 pichia:pp38非常不好壓~~多試試其他品牌抗體吧 02/06 23:55
6F：→ lancerjojo:嗚...但是老闆最近就要結果了說... 02/07 01:38
7F：推 aurth:2抗後用TBST多洗幾次看看...看起來像是沒洗乾淨 02/08 00:28
8F：→ lancerjojo:我曾經洗過2小時的，每10分鐘換一次 02/08 01:08
9F：→ crypupa:cell signaling的#9211 pp38(Thr180/Tyr182)很好壓 可以試 02/08 09:20
10F：推 tsubasawolfy:假如你的specific signal很強的話 降低一抗濃度吧 02/08 09:59