作者lancerjojo (JOJO)
看板Biotech
标题[求救] phospho p38 的western blot
时间Sat Feb 6 14:35:19 2010
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
各位板上的前辈们
小弟最近在压phospho p38的western blot
用的一抗是cell signaling的一抗
二抗则是millipore的goat anti-rabbit IGg
但是压出来的东西实在是不能看
在重要的位置都会出现黑色的背景
中间的部份会比较乾净
╴╴╴╴╴╴╴╴╴
▏ ▏
▏ ○ ▏
▏ ▏
▔▔▔▔▔▔▔▔▔
如上图，以中间圆圈为中心往外是乾净的
但是越到外围越黑
我一抗後是以TBST wash 3次 每次10分钟
二抗则是以TBST wash 6次 每次10分中
以shaker摇晃约125 rpm
这是第一个状况
第二个状况是
一条lane中出现其他的band
理论上来说是不应该出现的
本来我一抗的时间是4度C O/N 但是发现会洗不乾净之後改室温 1hr
(还是很脏就是了)
二抗则是室温 1HR 後来改30min
一抗的浓度为1:1000
二抗则为1:5000
我试过二抗用1:10000
但是却还是会在外围的地方背景较黑
不过有明显变的比较乾净
但是与中间比起来较为黑
不知道请问我该如何解决呢?
我已经压了一个月了............
谢谢各位大德
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.93.162
1F：推 tsubasawolfy:datasheet不是写4度C O/N? 02/06 14:47
2F：→ lancerjojo:楼上的大大~ 我本来就是用4度C O/N 不过还是会脏 也会 02/06 15:00
3F：→ lancerjojo:出现多条BAND 02/06 15:00
※ 编辑: lancerjojo 来自: 192.192.93.162 (02/06 15:03)
4F：推 celestial318:blocking用BSA试试? 02/06 23:36
5F：推 pichia:pp38非常不好压~~多试试其他品牌抗体吧 02/06 23:55
6F：→ lancerjojo:呜...但是老板最近就要结果了说... 02/07 01:38
7F：推 aurth:2抗後用TBST多洗几次看看...看起来像是没洗乾净 02/08 00:28
8F：→ lancerjojo:我曾经洗过2小时的，每10分钟换一次 02/08 01:08
9F：→ crypupa:cell signaling的#9211 pp38(Thr180/Tyr182)很好压 可以试 02/08 09:20
10F：推 tsubasawolfy:假如你的specific signal很强的话 降低一抗浓度吧 02/08 09:59