※ 引述《wayne841503 (JPG)》之銘言： : 因為最近要幫老師做專題遇到了一些問題... : 有蠻多不懂的地方想請教一下板友 : 就是該實驗最後要用real time PCR 去定量看gene的表現量 : 而事前要將抽RNA後轉成cDNA 再拿cDNA去做real time : 我們實驗室是用Trizol去抽... : 照理說抽出來的應該是細胞內所有的RNA (包含mRNA rRNA) : 而後用OligodT去轉cDNA ←應該是所有細胞中的mRNA都會被轉成cDNA對吧? : 之後就將cDNA拿去用待測gene的primer去夾用PCR放大 : 因為目前還不知道要挑哪些gene出來測 : 所以我們BOSS是說 : 先把RNA抽出送去做PCR array再從中挑幾個用real time去檢測是否符合 : 我們BOSS說每個濃度只要做一管轉成cDNA就好 : 之後的real time都可以用那管去做 : 我的疑問是...今天待測基因約有5個 : 而且要做3重複 如果都從那管有整個細胞的mRNA轉成的cDNA取出 應該會不夠 : 那如果要將該管cDNA用PCR放大 : 那primer要怎麼辦? 因為你不知道那管cDNA的組成 那你要怎麼去放大全部的片段? RT-PCR用oligo dT作為primer 用Impron II RT enzyme 1 ug就可轉成20ul的cDNA 做real-time更省 只要10ng左右的cDNA就夠了 可以做Ｎ次 你的濃度很高 應該不會不夠 : 還有一個問題...就是我可以先把加藥處理完的細胞都抽RNA轉成cDNA : 那以後就可以不用再養細胞 而只要從那管cDNA去做就好 這樣嗎 ?? : 這是第一次做PCR所以有很都不懂的地方...請大家幫忙看一下是否觀念有錯 : 謝謝^^ 你可以都從那管cDNA來做就好 可是不擔心這樣沒有重覆性嗎？ 要測五種gene不擔心剛好只有那次的實驗有這樣的現象嗎？ 如果是我，我會再多做幾次細胞實驗，來confirm :) --

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