※ 引述《wayne841503 (JPG)》之铭言： : 因为最近要帮老师做专题遇到了一些问题... : 有蛮多不懂的地方想请教一下板友 : 就是该实验最後要用real time PCR 去定量看gene的表现量 : 而事前要将抽RNA後转成cDNA 再拿cDNA去做real time : 我们实验室是用Trizol去抽... : 照理说抽出来的应该是细胞内所有的RNA (包含mRNA rRNA) : 而後用OligodT去转cDNA ←应该是所有细胞中的mRNA都会被转成cDNA对吧? : 之後就将cDNA拿去用待测gene的primer去夹用PCR放大 : 因为目前还不知道要挑哪些gene出来测 : 所以我们BOSS是说 : 先把RNA抽出送去做PCR array再从中挑几个用real time去检测是否符合 : 我们BOSS说每个浓度只要做一管转成cDNA就好 : 之後的real time都可以用那管去做 : 我的疑问是...今天待测基因约有5个 : 而且要做3重复 如果都从那管有整个细胞的mRNA转成的cDNA取出 应该会不够 : 那如果要将该管cDNA用PCR放大 : 那primer要怎麽办? 因为你不知道那管cDNA的组成 那你要怎麽去放大全部的片段? RT-PCR用oligo dT作为primer 用Impron II RT enzyme 1 ug就可转成20ul的cDNA 做real-time更省 只要10ng左右的cDNA就够了 可以做Ｎ次 你的浓度很高 应该不会不够 : 还有一个问题...就是我可以先把加药处理完的细胞都抽RNA转成cDNA : 那以後就可以不用再养细胞 而只要从那管cDNA去做就好 这样吗 ?? : 这是第一次做PCR所以有很都不懂的地方...请大家帮忙看一下是否观念有错 : 谢谢^^ 你可以都从那管cDNA来做就好 可是不担心这样没有重覆性吗？ 要测五种gene不担心刚好只有那次的实验有这样的现象吗？ 如果是我，我会再多做几次细胞实验，来confirm :) --

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