※ 引述《jck0406 (jck)》之銘言： : 最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見 : 以下是我做clone的步驟 : 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp) : DDW 36.5 : 10X buffer 5 : dNTPs 4 : Primer-R 1.5 : Primer-F 1.5 : DNA polymerase 0.5 : 94度 10分 : 94度 1分 : 58度 40秒 : 72度 2分 : 72度 8分 : 重複30個cycle : 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND : clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。 : http://ppt.cc/w7Oi : 3) gel extraction : 4) 切RE : 10X buffer 6 ul : DNA 52 ul : BamHI 1.5 ul : EcoRI 1.5 ul : 作用37度，3小時 : 5) clean up後再跑電泳 : http://ppt.cc/SXMh : 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high ) : vector 4 ul : DNA 6 ul : ligation kit 10 ul : 7) clean up : 8) Tansformation: : 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml) : http://ppt.cc/picw : http://ppt.cc/yElL : 9)之後我再挑菌，培養O/N : 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND : http://ppt.cc/rTvE : http://ppt.cc/ztTE : 如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津 : ------------------------------------------------------------ : 另外我還想補充幾個問題： : a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去 : 最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？ : b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說 : 切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。 : 我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。 : c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分， : 冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。 : d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功， : 那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢? : 麻煩大家了，謝謝:D : clone新手留 最近也在PCR 本來先試一般的taq 條件抓到以後 條件轉到有proofreading的酵素 怎麼p都很多band 而且忘記做cotrol 後來做control 發現 control也是很多band 後來抓到 是buffer污染了 我沒看到你pcr有做control組 不知道你有沒有確定沒有污染 假設你確定沒有污染的話.... 你應該是在pcr的時候 把條件抓到有singleband 再往下做比較好 還是primer要不要重新設計一下 是不是專一性不夠 如果真的都不是上述問題 你要不要把切酵素的時間縮短 然後分開切 ECOR I一小時 做CLEAN UP 然後 XHO I 一小時 CLEAN UP ECOR I 頗強 搞不好會亂切 但理論上來說 你有切STICKY END 在接上VECTOR 除了 VECTOR當初沒切到 自己接回去 其他的 都要有ECORI 跟 XHO I的切位 才能接上 VECTOR 我覺得污染的可能性頗高 --

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