※ 引述《jck0406 (jck)》之铭言： : 最近clone一直出问题，所以想上来问一下大家的意见 : 以下是我做clone的步骤 : 1) PCR增幅出目标基因(约1000 bp) : DDW 36.5 : 10X buffer 5 : dNTPs 4 : Primer-R 1.5 : Primer-F 1.5 : DNA polymerase 0.5 : 94度 10分 : 94度 1分 : 58度 40秒 : 72度 2分 : 72度 8分 : 重复30个cycle : 2)跑 2% agarose gel ，因为之前一直跑出很多条BAND : clean up都无法清除，所以这次打算直接切胶。 : http://ppt.cc/w7Oi : 3) gel extraction : 4) 切RE : 10X buffer 6 ul : DNA 52 ul : BamHI 1.5 ul : EcoRI 1.5 ul : 作用37度，3小时 : 5) clean up後再跑电泳 : http://ppt.cc/SXMh : 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high ) : vector 4 ul : DNA 6 ul : ligation kit 10 ul : 7) clean up : 8) Tansformation: : 先冰上10分钟，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分钟，涂盘 O/N(LB agar Amp 50mg/ml) : http://ppt.cc/picw : http://ppt.cc/yElL : 9)之後我再挑菌，培养O/N : 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，结果怎麽跑出很多条BAND : http://ppt.cc/rTvE : http://ppt.cc/ztTE : 如果还要什麽资料我会尽快补上，希望大家可以指点迷津 : ------------------------------------------------------------ : 另外我还想补充几个问题： : a) 在步骤 7) ，我们实验室的人说不用clean up，可是我不小心给他做下去 : 最後是用TE buffer elute下来，不知道对transformation会不会有影响？ : b) 切过酵素的DNA不能存在-20度C吗? 因为我後来有做几次，还是失败，後来他们说 : 切过酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否则sticky end的单股部份会断掉。 : 我大概冰了2-3天不知道有没有影响。 : c) 我在ligation的部分，vector是用学姊之前切过酵素多的部分， : 冰在4度C约一个星期多，不知道有没有影响。 : d) 因为我transformation後有长菌，这样不是代表clone有成功， : 那为什麽後来抽plasmid跑PCR会什麽还是没有我要的东西呢? : 麻烦大家了，谢谢:D : clone新手留 最近也在PCR 本来先试一般的taq 条件抓到以後 条件转到有proofreading的酵素 怎麽p都很多band 而且忘记做cotrol 後来做control 发现 control也是很多band 後来抓到 是buffer污染了 我没看到你pcr有做control组 不知道你有没有确定没有污染 假设你确定没有污染的话.... 你应该是在pcr的时候 把条件抓到有singleband 再往下做比较好 还是primer要不要重新设计一下 是不是专一性不够 如果真的都不是上述问题 你要不要把切酵素的时间缩短 然後分开切 ECOR I一小时 做CLEAN UP 然後 XHO I 一小时 CLEAN UP ECOR I 颇强 搞不好会乱切 但理论上来说 你有切STICKY END 在接上VECTOR 除了 VECTOR当初没切到 自己接回去 其他的 都要有ECORI 跟 XHO I的切位 才能接上 VECTOR 我觉得污染的可能性颇高 --

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