作者jsi (jsi)
看板Biotech
標題Re: [求救] 請問各位'
時間Sat Jan 23 11:45:38 2010
※ 引述《uokoperfect (病態)》之銘言：
假設今天P了兩段PCR產物
兩段PCR產物5'跟3'各有100多個mer重複
A產物
5'--------------------------3'
3'--------------------------5'
5'-----------------------------3'
3'-----------------------------5' B產物
我做過兩產物之間重疊區域約20~30bp的實驗
先將A產物與B產物混合後，稀釋100倍，稱為mixture
將mixture進行denature-annealing-extention兩個cycle
mixture 6μl
10x buffer 5μl
10mM dNTP 1μl
Pfu 1μl
ddH20 37μl
total 50μl
95℃ 3 min
annealing℃(根據重疊區域計算) 5 min
extention℃(根據使用之Pfu) X min(根據要補的長度計算)
進行2 cycle
＊您的PCR產物重疊區很長，可考慮以末端20~30個重疊nt來計算annealing temp
接著直接將要擴增基因的一對末端primer加入，
10μM primer 1 1μl
10μM primer 2 1μl
進行PCR，此時annealing temp就要根據primer來計算囉!
參考看看，希望對您的實驗有幫助
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◆ From: 218.164.131.25
※ 編輯: jsi 來自: 218.164.131.25 (01/23 11:48)
1F：推 uokoperfect:謝謝你的詳細回答 01/23 11:58
2F：推 ksn:我有個問題是pfu 3'to 5' exonuclease 活性會不會 remove 掉第 01/23 14:12
3F：→ ksn:第二股的3'到 5' 段? @ @ 01/23 14:12
4F：→ ksn:感謝，應該是我想錯了 若完全互補應該沒有問題~ 01/23 14:19