作者jsi (jsi)
看板Biotech
标题Re: [求救] 请问各位'
时间Sat Jan 23 11:45:38 2010
※ 引述《uokoperfect (病态)》之铭言：
假设今天P了两段PCR产物
两段PCR产物5'跟3'各有100多个mer重复
A产物
5'--------------------------3'
3'--------------------------5'
5'-----------------------------3'
3'-----------------------------5' B产物
我做过两产物之间重叠区域约20~30bp的实验
先将A产物与B产物混合後，稀释100倍，称为mixture
将mixture进行denature-annealing-extention两个cycle
mixture 6μl
10x buffer 5μl
10mM dNTP 1μl
Pfu 1μl
ddH20 37μl
total 50μl
95℃ 3 min
annealing℃(根据重叠区域计算) 5 min
extention℃(根据使用之Pfu) X min(根据要补的长度计算)
进行2 cycle
＊您的PCR产物重叠区很长，可考虑以末端20~30个重叠nt来计算annealing temp
接着直接将要扩增基因的一对末端primer加入，
10μM primer 1 1μl
10μM primer 2 1μl
进行PCR，此时annealing temp就要根据primer来计算罗!
参考看看，希望对您的实验有帮助
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◆ From: 218.164.131.25
※ 编辑: jsi 来自: 218.164.131.25 (01/23 11:48)
1F：推 uokoperfect:谢谢你的详细回答 01/23 11:58
2F：推 ksn:我有个问题是pfu 3'to 5' exonuclease 活性会不会 remove 掉第 01/23 14:12
3F：→ ksn:第二股的3'到 5' 段? @ @ 01/23 14:12
4F：→ ksn:感谢，应该是我想错了 若完全互补应该没有问题~ 01/23 14:19