作者pei24 (黑哥)
看板Biotech
標題[求救] 有關冷凍切片前處理
時間Mon Jan 18 14:00:10 2010
目前實驗是取出小鼠spinal cord L4~L6 做染色，但是最近發現切片破洞越來越多，希
望版友們給個意見，以利實驗改進
在取出spinal cord之前必須以 perfusion 方式固定
以下是我目前的作法
1. Calcium free tyrode 30~50 ml
2. 4% PFA 100-200 ml
3. 10% sucrose 30-50 ml
4. 取出 spinal cord L4~L6，於4℃ 泡在 20% sucroseu 24 hr，待沉降之後改泡
於4℃30% sucrose 72 小時
5. 以O.C.T包埋後先凍於 -20℃，等O.C.T變成乳白色之後改凍於 -80℃
6. 切片前先把組織拿到切片機預冷約2小時之後開始切片 (厚度 10 um)
7. 切片完利用電風扇把組織切片風乾約30分鐘後儲存於 -20℃，待日後染色
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我懷疑我的切片破洞是脫水不完全造成的
再加上我找了paper發現大多數的perfusion都有post-fixation
因此我想要修改我的perfusion步驟
1. Calcium free tyrode 30~50 ml
2. 4% PFA 100-200 ml
3. 取出 spinal cord L4~L6 於4℃ 4% PFA 一小時(post-fixation)
4. 再把組織換到20% sucrose，待沉降之後改泡於4℃ 30% sucrose 72 小時
5. 接下來就是包埋切片
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問題:
1.perfusion步驟修改後是否可行???或者哪裡需要再做修改???
2.組織的直徑長度約 2 mm，post-fixation 1小時夠嗎???
3.之前有聽學長姐說過 post-fixation 後的組織有可能染不出來???
希望以上3個問題，經驗豐富的版友們能提供寶貴意見做為實驗改進，感激您們..
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.90.35
1F：推 kittyen:我做的是P10幼鼠mice的腦 post-fixation 4% PFA 18hr 01/19 13:13
2F：→ kittyen:一定要post fixation 時間太長或太短腦都會有破洞 01/19 13:14
3F：→ allisa:你後固定1HR有點短 我取DRG都要後固定4HR了 延長看看吧~ 01/19 16:13
4F：→ allisa:染不出來是因為後固定時間過久 染IHC會比較難染 01/19 16:14