作者pei24 (黑哥)
看板Biotech
标题[求救] 有关冷冻切片前处理
时间Mon Jan 18 14:00:10 2010
目前实验是取出小鼠spinal cord L4~L6 做染色，但是最近发现切片破洞越来越多，希
望版友们给个意见，以利实验改进
在取出spinal cord之前必须以 perfusion 方式固定
以下是我目前的作法
1. Calcium free tyrode 30~50 ml
2. 4% PFA 100-200 ml
3. 10% sucrose 30-50 ml
4. 取出 spinal cord L4~L6，於4℃ 泡在 20% sucroseu 24 hr，待沉降之後改泡
於4℃30% sucrose 72 小时
5. 以O.C.T包埋後先冻於 -20℃，等O.C.T变成乳白色之後改冻於 -80℃
6. 切片前先把组织拿到切片机预冷约2小时之後开始切片 (厚度 10 um)
7. 切片完利用电风扇把组织切片风乾约30分钟後储存於 -20℃，待日後染色
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我怀疑我的切片破洞是脱水不完全造成的
再加上我找了paper发现大多数的perfusion都有post-fixation
因此我想要修改我的perfusion步骤
1. Calcium free tyrode 30~50 ml
2. 4% PFA 100-200 ml
3. 取出 spinal cord L4~L6 於4℃ 4% PFA 一小时(post-fixation)
4. 再把组织换到20% sucrose，待沉降之後改泡於4℃ 30% sucrose 72 小时
5. 接下来就是包埋切片
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问题:
1.perfusion步骤修改後是否可行???或者哪里需要再做修改???
2.组织的直径长度约 2 mm，post-fixation 1小时够吗???
3.之前有听学长姐说过 post-fixation 後的组织有可能染不出来???
希望以上3个问题，经验丰富的版友们能提供宝贵意见做为实验改进，感激您们..
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.90.35
1F：推 kittyen:我做的是P10幼鼠mice的脑 post-fixation 4% PFA 18hr 01/19 13:13
2F：→ kittyen:一定要post fixation 时间太长或太短脑都会有破洞 01/19 13:14
3F：→ allisa:你後固定1HR有点短 我取DRG都要後固定4HR了 延长看看吧~ 01/19 16:13
4F：→ allisa:染不出来是因为後固定时间过久 染IHC会比较难染 01/19 16:14