※ 引述《jck0406 (jck)》之銘言： : 最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見 : 以下是我做clone的步驟 : 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp) : DDW 36.5 : 10X buffer 5 : dNTPs 4 : Primer-R 1.5 : Primer-F 1.5 : DNA polymerase 0.5 : 94度 10分 : 94度 1分 : 58度 40秒 : 72度 2分 : 72度 8分 : 重複30個cycle 使用的polymerase為何？ 使用前請先看datasheet，他會有一般的pre-heat/denature/anneal/extention的建議值 有的1kb/1min，有的1kb/2min，有的1kb/15sec，這些都會影響產物 primer的Tm值多少，用這個才能推估你的anneal的溫度 另外，你上面的配方沒有提到template？ : 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND : clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。 : http://ppt.cc/w7Oi 1kb的產物用2％太奢侈了，0.8％或者1％就夠了 clean up kit本來就不是純化單一條band的工具 他只是把「所有」的DNA都純化下來，請先瞭解手頭上的工具的作用 : 3) gel extraction : 4) 切RE : 10X buffer 6 ul : DNA 52 ul : BamHI 1.5 ul : EcoRI 1.5 ul : 作用37度，3小時 哪一牌的酵素？ 不同酵素廠商作用時間建議不同 是否可以double digest也不同 （雖然這兩種都是很好切的酵素......） 反應的體積也需要考慮 60ul是一個很奇怪的數字，如果是我做的話 我寧願20ul做兩管 過去也曾經做50ul或者100ul一管 但是效果並不會跟20ul做一管，多做幾個重複一樣，只會更差 有可能跟管子中的碰撞頻率有關 : 5) clean up後再跑電泳 : http://ppt.cc/SXMh : 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high ) : vector 4 ul : DNA 6 ul : ligation kit 10 ul vector跟insert的molar ration？ : 7) clean up 這一步是否必要？ 每次純化就是將你的DNA再減少一點 如果不是必要，盡可能減少純化步驟 : 8) Tansformation: : 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml) : http://ppt.cc/picw : http://ppt.cc/yElL heat/cold shock完，可以試著加入1ml LB培養兩小時讓你的clone複製多一點 同時讓抗性基因表現，可能可以將bacground降低 : 9)之後我再挑菌，培養O/N : 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND : http://ppt.cc/rTvE : http://ppt.cc/ztTE : 如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津 如果一開始的條件不是很專一 在這邊就不用期待看到專一產物 既然plasmid都抽了，用restrictio enzyme切也不是不好 : ------------------------------------------------------------ : 另外我還想補充幾個問題： : a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去 : 最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？ : b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說 : 切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。 : 我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。 : c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分， : 冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。 : d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功， : 那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢? : 麻煩大家了，謝謝:D : clone新手留 超過一星期的，最好重新再切一遍 過去放在-20的DNA大概過一個月還勉強可以用 但是如果是新手，建議全部自己一步一步做 plate上面有菌落，只是代表這一棵clony可以抗你的抗生素 可能是對的，可能是self-ligation 也可能是污染菌，抗生素不是萬能 如果要PCR的話，直接做colony PCR可以一次做一堆clone 只要你老闆不會火大就好了:P 加油囉～ --

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