※ 引述《jck0406 (jck)》之铭言： : 最近clone一直出问题，所以想上来问一下大家的意见 : 以下是我做clone的步骤 : 1) PCR增幅出目标基因(约1000 bp) : DDW 36.5 : 10X buffer 5 : dNTPs 4 : Primer-R 1.5 : Primer-F 1.5 : DNA polymerase 0.5 : 94度 10分 : 94度 1分 : 58度 40秒 : 72度 2分 : 72度 8分 : 重复30个cycle 使用的polymerase为何？ 使用前请先看datasheet，他会有一般的pre-heat/denature/anneal/extention的建议值 有的1kb/1min，有的1kb/2min，有的1kb/15sec，这些都会影响产物 primer的Tm值多少，用这个才能推估你的anneal的温度 另外，你上面的配方没有提到template？ : 2)跑 2% agarose gel ，因为之前一直跑出很多条BAND : clean up都无法清除，所以这次打算直接切胶。 : http://ppt.cc/w7Oi 1kb的产物用2％太奢侈了，0.8％或者1％就够了 clean up kit本来就不是纯化单一条band的工具 他只是把「所有」的DNA都纯化下来，请先了解手头上的工具的作用 : 3) gel extraction : 4) 切RE : 10X buffer 6 ul : DNA 52 ul : BamHI 1.5 ul : EcoRI 1.5 ul : 作用37度，3小时 哪一牌的酵素？ 不同酵素厂商作用时间建议不同 是否可以double digest也不同 （虽然这两种都是很好切的酵素......） 反应的体积也需要考虑 60ul是一个很奇怪的数字，如果是我做的话 我宁愿20ul做两管 过去也曾经做50ul或者100ul一管 但是效果并不会跟20ul做一管，多做几个重复一样，只会更差 有可能跟管子中的碰撞频率有关 : 5) clean up後再跑电泳 : http://ppt.cc/SXMh : 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high ) : vector 4 ul : DNA 6 ul : ligation kit 10 ul vector跟insert的molar ration？ : 7) clean up 这一步是否必要？ 每次纯化就是将你的DNA再减少一点 如果不是必要，尽可能减少纯化步骤 : 8) Tansformation: : 先冰上10分钟，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分钟，涂盘 O/N(LB agar Amp 50mg/ml) : http://ppt.cc/picw : http://ppt.cc/yElL heat/cold shock完，可以试着加入1ml LB培养两小时让你的clone复制多一点 同时让抗性基因表现，可能可以将bacground降低 : 9)之後我再挑菌，培养O/N : 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，结果怎麽跑出很多条BAND : http://ppt.cc/rTvE : http://ppt.cc/ztTE : 如果还要什麽资料我会尽快补上，希望大家可以指点迷津 如果一开始的条件不是很专一 在这边就不用期待看到专一产物 既然plasmid都抽了，用restrictio enzyme切也不是不好 : ------------------------------------------------------------ : 另外我还想补充几个问题： : a) 在步骤 7) ，我们实验室的人说不用clean up，可是我不小心给他做下去 : 最後是用TE buffer elute下来，不知道对transformation会不会有影响？ : b) 切过酵素的DNA不能存在-20度C吗? 因为我後来有做几次，还是失败，後来他们说 : 切过酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否则sticky end的单股部份会断掉。 : 我大概冰了2-3天不知道有没有影响。 : c) 我在ligation的部分，vector是用学姊之前切过酵素多的部分， : 冰在4度C约一个星期多，不知道有没有影响。 : d) 因为我transformation後有长菌，这样不是代表clone有成功， : 那为什麽後来抽plasmid跑PCR会什麽还是没有我要的东西呢? : 麻烦大家了，谢谢:D : clone新手留 超过一星期的，最好重新再切一遍 过去放在-20的DNA大概过一个月还勉强可以用 但是如果是新手，建议全部自己一步一步做 plate上面有菌落，只是代表这一棵clony可以抗你的抗生素 可能是对的，可能是self-ligation 也可能是污染菌，抗生素不是万能 如果要PCR的话，直接做colony PCR可以一次做一堆clone 只要你老板不会火大就好了:P 加油罗～ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 114.46.112.222 ※ 编辑: milkpa 来自: 114.46.112.222 (01/16 23:33)