有些地方我提供一點小小意見,供您參考^^ : 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND : clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。 既然很多條band，要如何肯定在位置差不多的那條band是所要的產物？ 如果不能確定，那即使做gel extraction也會挖到錯的DNA : 3) gel extraction : 4) 切RE : 10X buffer 6 ul : DNA 52 ul : BamHI 1.5 ul : EcoRI 1.5 ul : 作用37度，3小時 : 5) clean up後再跑電泳 : http://ppt.cc/SXMh 因為你是兩種酵素同時作用，如果可以，確認一下在你的實驗時要條件下 兩個酵素同時作用時效力是可接受的 (我之前的經驗是,依照酵素說明書的建議， 選了一種可以使兩種酵素同時有75%作用的buffer，同時用兩種酵素做切割 但是事實告訴我說明書的建議有時候聽聽就好 因為使用它建議的buffer,酵素連75%的效力都達不到... 後來我就分兩次進行酵素切割了) : 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high ) : vector 4 ul : DNA 6 ul : ligation kit 10 ul : 7) clean up : 8) Tansformation: : 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml) : http://ppt.cc/picw : http://ppt.cc/yElL : 9)之後我再挑菌，培養O/N : 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND 這對primer會得到很多雜band，在一開始的結果就知道了， 所以在這個步驟看到很多雜band我也不覺得奇怪。 你要不要考慮用enzyme digestion的方式切看看，看能不能切出你接進去的insert。 : ------------------------------------------------------------ : 另外我還想補充幾個問題： : a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去 : 最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？ clean up有可能會降低ligation產物的量，如果transformation的效率又不好， 得到正確的colony的機會有可能變少 我自己作cloning是沒有作clean up，ligation產物就直接進行transformation 因為我的想法是ligation成功的產物就很少了,我不想要丟失任何的DNA : b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說 : 切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。 : 我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。 我切過酵素的DNA也都冰-20度C，且根據之前cloning高手的說法， 他冰的DNA過了很久很久之後都來可以用...所以我覺得這個因素影響可能不大 : c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分， : 冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。 我之前用的vector是某cloning高手冰在-20度C三四年的產物， 我還是有接成功耶...所以...可能還好吧 : d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功， : 那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢? 你的vector可能會切不乾淨，而self-ligation成原來vector 那些vector就會使細菌漲出colony來，這個我不覺得很奇怪。 cloning的眉眉角角很多，試著一個一個釐清，多問多學，會從中得到很多經驗的， 希望我的想法對你有幫助，加油啦~^^ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 211.76.175.139 ※ 編輯: lail 來自: 211.76.175.139 (01/16 19:52) 你是指學姊的vector已經self ligation的意思嗎? 有人會在切完enzyme後作CIP，降低只切一刀的vector self-ligation的機會， 如果兩刀都切乾淨，理論上也應該無法self-ligation 因為不知道你的學姊切enzyme的步驟，所以我不敢說。 如果真的擔心，就自己切vector好了 如果primer專一，vector理論上是無法得到產物的 可是你的primer看起來專一性不怎麼好， 所以看到最後的結果band很多其實不會很意外 ※ 編輯: lail 來自: 211.76.175.139 (01/16 20:26)