有些地方我提供一点小小意见,供您参考^^ : 2)跑 2% agarose gel ，因为之前一直跑出很多条BAND : clean up都无法清除，所以这次打算直接切胶。 既然很多条band，要如何肯定在位置差不多的那条band是所要的产物？ 如果不能确定，那即使做gel extraction也会挖到错的DNA : 3) gel extraction : 4) 切RE : 10X buffer 6 ul : DNA 52 ul : BamHI 1.5 ul : EcoRI 1.5 ul : 作用37度，3小时 : 5) clean up後再跑电泳 : http://ppt.cc/SXMh 因为你是两种酵素同时作用，如果可以，确认一下在你的实验时要条件下 两个酵素同时作用时效力是可接受的 (我之前的经验是,依照酵素说明书的建议， 选了一种可以使两种酵素同时有75%作用的buffer，同时用两种酵素做切割 但是事实告诉我说明书的建议有时候听听就好 因为使用它建议的buffer,酵素连75%的效力都达不到... 後来我就分两次进行酵素切割了) : 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high ) : vector 4 ul : DNA 6 ul : ligation kit 10 ul : 7) clean up : 8) Tansformation: : 先冰上10分钟，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分钟，涂盘 O/N(LB agar Amp 50mg/ml) : http://ppt.cc/picw : http://ppt.cc/yElL : 9)之後我再挑菌，培养O/N : 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，结果怎麽跑出很多条BAND 这对primer会得到很多杂band，在一开始的结果就知道了， 所以在这个步骤看到很多杂band我也不觉得奇怪。 你要不要考虑用enzyme digestion的方式切看看，看能不能切出你接进去的insert。 : ------------------------------------------------------------ : 另外我还想补充几个问题： : a) 在步骤 7) ，我们实验室的人说不用clean up，可是我不小心给他做下去 : 最後是用TE buffer elute下来，不知道对transformation会不会有影响？ clean up有可能会降低ligation产物的量，如果transformation的效率又不好， 得到正确的colony的机会有可能变少 我自己作cloning是没有作clean up，ligation产物就直接进行transformation 因为我的想法是ligation成功的产物就很少了,我不想要丢失任何的DNA : b) 切过酵素的DNA不能存在-20度C吗? 因为我後来有做几次，还是失败，後来他们说 : 切过酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否则sticky end的单股部份会断掉。 : 我大概冰了2-3天不知道有没有影响。 我切过酵素的DNA也都冰-20度C，且根据之前cloning高手的说法， 他冰的DNA过了很久很久之後都来可以用...所以我觉得这个因素影响可能不大 : c) 我在ligation的部分，vector是用学姊之前切过酵素多的部分， : 冰在4度C约一个星期多，不知道有没有影响。 我之前用的vector是某cloning高手冰在-20度C三四年的产物， 我还是有接成功耶...所以...可能还好吧 : d) 因为我transformation後有长菌，这样不是代表clone有成功， : 那为什麽後来抽plasmid跑PCR会什麽还是没有我要的东西呢? 你的vector可能会切不乾净，而self-ligation成原来vector 那些vector就会使细菌涨出colony来，这个我不觉得很奇怪。 cloning的眉眉角角很多，试着一个一个厘清，多问多学，会从中得到很多经验的， 希望我的想法对你有帮助，加油啦~^^ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 211.76.175.139 ※ 编辑: lail 来自: 211.76.175.139 (01/16 19:52) 你是指学姊的vector已经self ligation的意思吗? 有人会在切完enzyme後作CIP，降低只切一刀的vector self-ligation的机会， 如果两刀都切乾净，理论上也应该无法self-ligation 因为不知道你的学姊切enzyme的步骤，所以我不敢说。 如果真的担心，就自己切vector好了 如果primer专一，vector理论上是无法得到产物的 可是你的primer看起来专一性不怎麽好， 所以看到最後的结果band很多其实不会很意外 ※ 编辑: lail 来自: 211.76.175.139 (01/16 20:26)