作者jck0406 (jck)
看板Biotech
標題[求救] clone不出來
時間Sat Jan 16 18:28:03 2010
最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見
以下是我做clone的步驟
1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp)
DDW 36.5
10X buffer 5
dNTPs 4
Primer-R 1.5
Primer-F 1.5
DNA polymerase 0.5
94度 10分
94度 1分
58度 40秒
72度 2分
72度 8分
重複30個cycle
2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND
clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。
http://ppt.cc/w7Oi
3) gel extraction
4) 切RE
10X buffer 6 ul
DNA 52 ul
BamHI 1.5 ul
EcoRI 1.5 ul
作用37度，3小時
5) clean up後再跑電泳
http://ppt.cc/SXMh
6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high )
vector 4 ul
DNA 6 ul
ligation kit 10 ul
7) clean up
8) Tansformation:
先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml)
http://ppt.cc/picw
http://ppt.cc/yElL
9)之後我再挑菌，培養O/N
10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND
http://ppt.cc/rTvE
http://ppt.cc/ztTE
如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津
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另外我還想補充幾個問題：
a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去
最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？
b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說
切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。
我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。
c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分，
冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。
d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功，
那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢?
麻煩大家了，謝謝:D
clone新手留
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◆ From: 59.120.120.118
1F：推 aceliang:a)沒差，會loss b)我都冰-20 c)影響不大 d)self ligation 01/16 19:56
2F：→ jck0406:謝謝~ :) 01/16 20:16
3F：→ foxrose:那就先TA cloning 再切insert出來 接到原本想接的vector 01/16 23:36
4F：→ foxrose:就算很多band TA之後就挑很多clone 總會有對的吧 (by seq) 01/16 23:38
5F：推 ksn:plasmid用enzyme雙切看1kb band有沒有出來。PCR primer本來就 01/17 16:04
6F：→ ksn:夾不出single band了，用來check plasmid感覺不好用@ @ 01/17 16:05
7F：→ ksn:或是單切plasmid看大小有沒有比vector only大1kb，若都沒有， 01/17 16:07
8F：→ ksn:再考慮上面實驗的問題 01/17 16:08
9F：→ jck0406:不好意思，想請問K大，PCR primer夾不出single band。 01/17 20:07
10F：→ jck0406:是什麼意思阿? 01/17 20:07
11F：→ ksn:唔..抱歉~習慣用語 意思是指PCR產物跑膠會產生很多條band 01/17 23:46
12F：→ ksn:文章開頭因為多條band必須進行gel extraction，若用相同primer 01/17 23:51
13F：→ ksn:及條件進行最後plasmid確認的話，認為不太能確定有沒有成功~ 01/17 23:52
14F：→ ksn:這邊只是開頭想先確認 是PCR的問題 還是 clone 方式的問題 01/18 00:05