作者jck0406 (jck)
看板Biotech
标题[求救] clone不出来
时间Sat Jan 16 18:28:03 2010
最近clone一直出问题，所以想上来问一下大家的意见
以下是我做clone的步骤
1) PCR增幅出目标基因(约1000 bp)
DDW 36.5
10X buffer 5
dNTPs 4
Primer-R 1.5
Primer-F 1.5
DNA polymerase 0.5
94度 10分
94度 1分
58度 40秒
72度 2分
72度 8分
重复30个cycle
2)跑 2% agarose gel ，因为之前一直跑出很多条BAND
clean up都无法清除，所以这次打算直接切胶。
http://ppt.cc/w7Oi
3) gel extraction
4) 切RE
10X buffer 6 ul
DNA 52 ul
BamHI 1.5 ul
EcoRI 1.5 ul
作用37度，3小时
5) clean up後再跑电泳
http://ppt.cc/SXMh
6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high )
vector 4 ul
DNA 6 ul
ligation kit 10 ul
7) clean up
8) Tansformation:
先冰上10分钟，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分钟，涂盘 O/N(LB agar Amp 50mg/ml)
http://ppt.cc/picw
http://ppt.cc/yElL
9)之後我再挑菌，培养O/N
10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，结果怎麽跑出很多条BAND
http://ppt.cc/rTvE
http://ppt.cc/ztTE
如果还要什麽资料我会尽快补上，希望大家可以指点迷津
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另外我还想补充几个问题：
a) 在步骤 7) ，我们实验室的人说不用clean up，可是我不小心给他做下去
最後是用TE buffer elute下来，不知道对transformation会不会有影响？
b) 切过酵素的DNA不能存在-20度C吗? 因为我後来有做几次，还是失败，後来他们说
切过酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否则sticky end的单股部份会断掉。
我大概冰了2-3天不知道有没有影响。
c) 我在ligation的部分，vector是用学姊之前切过酵素多的部分，
冰在4度C约一个星期多，不知道有没有影响。
d) 因为我transformation後有长菌，这样不是代表clone有成功，
那为什麽後来抽plasmid跑PCR会什麽还是没有我要的东西呢?
麻烦大家了，谢谢:D
clone新手留
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◆ From: 59.120.120.118
1F：推 aceliang:a)没差，会loss b)我都冰-20 c)影响不大 d)self ligation 01/16 19:56
2F：→ jck0406:谢谢~ :) 01/16 20:16
3F：→ foxrose:那就先TA cloning 再切insert出来 接到原本想接的vector 01/16 23:36
4F：→ foxrose:就算很多band TA之後就挑很多clone 总会有对的吧 (by seq) 01/16 23:38
5F：推 ksn:plasmid用enzyme双切看1kb band有没有出来。PCR primer本来就 01/17 16:04
6F：→ ksn:夹不出single band了，用来check plasmid感觉不好用@ @ 01/17 16:05
7F：→ ksn:或是单切plasmid看大小有没有比vector only大1kb，若都没有， 01/17 16:07
8F：→ ksn:再考虑上面实验的问题 01/17 16:08
9F：→ jck0406:不好意思，想请问K大，PCR primer夹不出single band。 01/17 20:07
10F：→ jck0406:是什麽意思阿? 01/17 20:07
11F：→ ksn:唔..抱歉~习惯用语 意思是指PCR产物跑胶会产生很多条band 01/17 23:46
12F：→ ksn:文章开头因为多条band必须进行gel extraction，若用相同primer 01/17 23:51
13F：→ ksn:及条件进行最後plasmid确认的话，认为不太能确定有没有成功~ 01/17 23:52
14F：→ ksn:这边只是开头想先确认 是PCR的问题 还是 clone 方式的问题 01/18 00:05