作者faycos (fay)
看板Biotech
標題[方法] 皮膚冷凍切片
時間Wed Jan 13 16:59:23 2010
因為實驗室的學長姐之前只做過骨頭的冷凍切片,而且只H&E染色
其他組織是做石蠟切片(做IHC)
但是我是要做小鼠皮膚組織的冷凍切片,要做IHC跟IF
目前我看實驗室的protocol有幾個地方覺得怪怪的
1.冷凍切片組織完全沒有固定這個步驟
切完片就-20度C保存,染色前PBS wash
2. IHC跟IF的 blocking 用 奶粉泡
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我參考santa cruz 跟 IHC world 的protocol
santa cruz建議:
切片後染色前用冰的acetone 固定10 mins,
blocking用 10% normal serum/PBS
IHC world建議:
切完片的瞬間,馬上把slide放到95% EtOH固定
我要染的那幾個蛋白(PCNA,mmp-1)不需要blocking
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另外,目前試做發現用PBS wash,組織很多都漂起來,問其他做骨切片的也是這樣
造成好幾片切片都不能用,有沒有什麼好方法?
可以請有經驗的人給我一點意見嗎? 非常困擾
謝謝大家~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.64.100
1F：→ runpapa0520:你有用coating 片嗎? 01/13 17:30
2F：→ kotenka:我切完會放在bench上風乾o/n，隔天可以直接染或放-80保存 01/13 20:19
3F：→ kotenka:染色前用4% PFA或acetone固定，blocking用10%二抗的血清 01/13 20:20
4F：→ maplestar48:切片厚度不要太厚!你的是切多少? 01/13 22:32
5F：→ faycos:我是使用coating片沒錯,厚度是5~8um 01/14 21:17
6F：推 maplestar48:在貼片時~盡可能不要折到切下來的OCT~一有空隙很容易 01/14 22:40
7F：→ maplestar48:漂走~不然就是在wash時不要整個下去洗~用tip抽吸抽吸~ 01/14 22:40
8F：推 kotenka:我也是小鼠皮膚，切5micron，但從來沒掉過阿，原PO要不要 01/15 01:18
9F：→ kotenka:換其他廠牌的玻片看看阿，wash要用tip抽吸實在很麻煩@@ 01/15 01:19
10F：→ faycos:k大,請問你是用哪一家的玻片阿? 01/15 01:28
11F：推 kotenka:Thermo的。另外可能包埋的過程也沒做好吧，你包埋前有用 01/15 13:26
12F：→ kotenka:30% sucrose脫水嗎？然後切完片一定要風乾 01/15 13:26
13F：→ faycos:感謝k大,看來我是因為沒有風乾,現在好多了 01/17 19:51
14F：推 x750328:我也是切小鼠皮膚,有時sample太小做IHC很容易脫落 01/19 17:03
15F：→ x750328:如果沒辦法改善的話,可以考慮自己coating喔 01/19 17:03
16F：→ x750328:可以調整lysine的濃度,片子品質會比常傷賣得好喔 01/19 17:04