作者faycos (fay)
看板Biotech
标题[方法] 皮肤冷冻切片
时间Wed Jan 13 16:59:23 2010
因为实验室的学长姐之前只做过骨头的冷冻切片,而且只H&E染色
其他组织是做石蜡切片(做IHC)
但是我是要做小鼠皮肤组织的冷冻切片,要做IHC跟IF
目前我看实验室的protocol有几个地方觉得怪怪的
1.冷冻切片组织完全没有固定这个步骤
切完片就-20度C保存,染色前PBS wash
2. IHC跟IF的 blocking 用 奶粉泡
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我参考santa cruz 跟 IHC world 的protocol
santa cruz建议:
切片後染色前用冰的acetone 固定10 mins,
blocking用 10% normal serum/PBS
IHC world建议:
切完片的瞬间,马上把slide放到95% EtOH固定
我要染的那几个蛋白(PCNA,mmp-1)不需要blocking
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另外,目前试做发现用PBS wash,组织很多都漂起来,问其他做骨切片的也是这样
造成好几片切片都不能用,有没有什麽好方法?
可以请有经验的人给我一点意见吗? 非常困扰
谢谢大家~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.64.100
1F：→ runpapa0520:你有用coating 片吗? 01/13 17:30
2F：→ kotenka:我切完会放在bench上风乾o/n，隔天可以直接染或放-80保存 01/13 20:19
3F：→ kotenka:染色前用4% PFA或acetone固定，blocking用10%二抗的血清 01/13 20:20
4F：→ maplestar48:切片厚度不要太厚!你的是切多少? 01/13 22:32
5F：→ faycos:我是使用coating片没错,厚度是5~8um 01/14 21:17
6F：推 maplestar48:在贴片时~尽可能不要折到切下来的OCT~一有空隙很容易 01/14 22:40
7F：→ maplestar48:漂走~不然就是在wash时不要整个下去洗~用tip抽吸抽吸~ 01/14 22:40
8F：推 kotenka:我也是小鼠皮肤，切5micron，但从来没掉过阿，原PO要不要 01/15 01:18
9F：→ kotenka:换其他厂牌的玻片看看阿，wash要用tip抽吸实在很麻烦@@ 01/15 01:19
10F：→ faycos:k大,请问你是用哪一家的玻片阿? 01/15 01:28
11F：推 kotenka:Thermo的。另外可能包埋的过程也没做好吧，你包埋前有用 01/15 13:26
12F：→ kotenka:30% sucrose脱水吗？然後切完片一定要风乾 01/15 13:26
13F：→ faycos:感谢k大,看来我是因为没有风乾,现在好多了 01/17 19:51
14F：推 x750328:我也是切小鼠皮肤,有时sample太小做IHC很容易脱落 01/19 17:03
15F：→ x750328:如果没办法改善的话,可以考虑自己coating喔 01/19 17:03
16F：→ x750328:可以调整lysine的浓度,片子品质会比常伤卖得好喔 01/19 17:04