作者syming ( )
看板Biotech
標題[求救] 請問關於抽取plasmid的問題
時間Tue Jan 12 19:48:43 2010
我目前是分生新手
有幾個疑問想要問各位先進
我目前在抽取plasmid的實驗
使用的方法是kit的步驟
但是有時候不知道哪邊出錯
取得plasmid 有時候會失敗
有時候會成功
不知道是哪邊出了問題
還有抽取plasmid kit的spin column 可以重複使用嗎?
因為幾次時驗完發現使用量非常大(過濾膜→spin column、solutionI、II、III)
抽取plasmid步驟:
1.離心菌體沉澱物
2.加入200uL solution I，用pipet使其懸浮
3.加入200uL solution II，上下搖晃數次，等溶液變透徹，但沒超過五分鐘
4.加入200uL solution III，上下搖晃後離心
5.吸取上層澄清液，加入spin column離心
6.加入600uL wash solution，離心 重複兩次
7.讓酒精乾，加入40uL elution solution 靜置
7.跑電泳膠片 DNA:dye=4:1
成功率70%
有考慮想要使用傳統的實驗步驟
及從膠體回收DNA目前很像都沒有成功…
因為再次跑膠片卻都沒有band出現
這邊我想要抽取的DNA大小約0.6kbp(從plasmid上面切下來的片段)
回收膠片dna也是用kit的步驟
回收膠體步驟:
1.割下欲回收膠片
2.加入略大於膠體體積的binding solution，加熱 使膠體溶解
3.加入spin column 離心過濾，再加入700uL binding solution 離心
4.wash solution 600 uL，離心 重複兩次
5.酒精乾，加入elution solution 50 uL
6.跑膠片
目前做的實驗沒有我切下來的DNA band出現
不知道在做抽取plasmid與膠片回收的實驗
有什麼需要注意 才可以使成功率提升
謝謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.113.77.200
1F：推 bee921:spin column應該是沒再重複使用~不懂你的()內的意思 01/12 20:03
2F：→ bee921:在膠上純化 是覺得要算回收率 才知道該下多少ug... 01/12 20:04
3F：→ turtle24:相同的DNA重複使用spin column應該是沒什麼問題 01/12 20:19
4F：→ turtle24:長時間的話還是換個新的比較好 01/12 20:21
5F：推 bider:能夠把實驗流程仔細講一下嗎 這樣比較方便大家判斷 01/12 20:25
6F：→ syming:那我在重新編輯 把步驟附上 感謝 01/12 20:34
※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (01/12 20:57)
7F：推 bider:養菌的時間多久呢? 菌太老也會引響產質 01/12 21:15
養菌overnight
8F：→ runpapa0520:你ELUTE太多拉 通常我會減半 (當初拿多少去切體績) 01/12 21:17
9F：→ bider:RE用多少量的DNA去反應 01/12 21:17
10F：→ runpapa0520:binding solution的量應該比膠多很多喔 看說明書 01/12 21:19
11F：推 bider:沒記錯是約1:3 01/12 21:20
嗯嗯 這邊我加入bind solution 應該有大於三倍
12F：推 conective:樓上說得沒錯是膠的3倍體積 01/12 21:26
13F：推 tsubasawolfy:成功率70%?? 這根有沒有挑到菌比較相關吧= = 01/12 21:49
挑菌…可是我是用LB直接去養 然後都是同一個菌株養出來的
有時成功 有時失敗 沒有一個穩定的100%成功 還是我自己的問題?
感謝 提供意見
那怎樣才會有再現性 就以抽取DNA與回收膠片的步驟
※ 編輯: syming 來自: 140.113.77.200 (01/12 22:08)
14F：→ ksn:回收膠wash完後column membrane正中央滴入elution 或ddH20, 01/13 00:42
15F：→ ksn:室溫靜置2~3分鐘後再離心。若是DNA後續有clone處理，建議用水 01/13 00:43
16F：→ ksn:唔..kit回收膠片最後wash完，DNA是在membrane上，非Wash buf中 01/13 00:45
17F：→ ksn:看來抽plasmid問題可能一樣，kit最後Elution步驟和傳統法差異 01/13 00:50
18F：推 enisx:elution那步我都用(放烘箱加熱)60度的ddH2O x2次 (建議量減 01/13 08:28
19F：→ enisx:半, 就是說明書要30uL,我會改成15uL兩次 01/13 08:29
20F：推 enisx:挑菌是怎麼挑?有可能沒挑到嗎? 另外LB養得濁濁的不代表就是 01/13 08:32
21F：推 enisx:spin管不要重複用了啦!少一個變因,各家競爭之下也不會太貴!! 01/13 08:36
22F：推 conective:LB應該有加抗生素吧@@? 通常有挑到不太可能出現抽質體 01/13 11:06
23F：→ conective:失敗的狀況可能有的菌把質體吐掉了 01/13 11:07
24F：→ conective:個人猜測 01/13 11:07
25F：→ iceking:建議你抽完之後,先去測260/280及濃度... 01/13 11:22
26F：推 mtdas:找人帶比較快 01/13 13:37
27F：→ Realthugz:雜菌? = = 01/13 20:38
28F：→ Realthugz:菌液濁濁的不一定是喔 我有一次發現不是E.coli... 01/13 20:40
29F：→ Realthugz:有的vector很快被吐掉產量很低 都要重新transform養大量 01/13 20:42
30F：推 icome:mini應該很好抽才對 通常沒抽到都是挑到雜菌了 01/14 13:24
31F：→ spirithorse:elute水加溫到75度,加個30ul,看要不要靜置久一點(1hr) 01/17 23:44
32F：→ spirithorse:有些column爛一點需要久一點時間,原本的plasmid切多點 01/17 23:46