作者syming ( )
看板Biotech
标题[求救] 请问关於抽取plasmid的问题
时间Tue Jan 12 19:48:43 2010
我目前是分生新手
有几个疑问想要问各位先进
我目前在抽取plasmid的实验
使用的方法是kit的步骤
但是有时候不知道哪边出错
取得plasmid 有时候会失败
有时候会成功
不知道是哪边出了问题
还有抽取plasmid kit的spin column 可以重复使用吗?
因为几次时验完发现使用量非常大(过滤膜→spin column、solutionI、II、III)
抽取plasmid步骤:
1.离心菌体沉淀物
2.加入200uL solution I，用pipet使其悬浮
3.加入200uL solution II，上下摇晃数次，等溶液变透彻，但没超过五分钟
4.加入200uL solution III，上下摇晃後离心
5.吸取上层澄清液，加入spin column离心
6.加入600uL wash solution，离心 重复两次
7.让酒精乾，加入40uL elution solution 静置
7.跑电泳胶片 DNA:dye=4:1
成功率70%
有考虑想要使用传统的实验步骤
及从胶体回收DNA目前很像都没有成功…
因为再次跑胶片却都没有band出现
这边我想要抽取的DNA大小约0.6kbp(从plasmid上面切下来的片段)
回收胶片dna也是用kit的步骤
回收胶体步骤:
1.割下欲回收胶片
2.加入略大於胶体体积的binding solution，加热 使胶体溶解
3.加入spin column 离心过滤，再加入700uL binding solution 离心
4.wash solution 600 uL，离心 重复两次
5.酒精乾，加入elution solution 50 uL
6.跑胶片
目前做的实验没有我切下来的DNA band出现
不知道在做抽取plasmid与胶片回收的实验
有什麽需要注意 才可以使成功率提升
谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.113.77.200
1F：推 bee921:spin column应该是没再重复使用~不懂你的()内的意思 01/12 20:03
2F：→ bee921:在胶上纯化 是觉得要算回收率 才知道该下多少ug... 01/12 20:04
3F：→ turtle24:相同的DNA重复使用spin column应该是没什麽问题 01/12 20:19
4F：→ turtle24:长时间的话还是换个新的比较好 01/12 20:21
5F：推 bider:能够把实验流程仔细讲一下吗 这样比较方便大家判断 01/12 20:25
6F：→ syming:那我在重新编辑 把步骤附上 感谢 01/12 20:34
※ 编辑: syming 来自: 140.113.77.200 (01/12 20:57)
7F：推 bider:养菌的时间多久呢? 菌太老也会引响产质 01/12 21:15
养菌overnight
8F：→ runpapa0520:你ELUTE太多拉 通常我会减半 (当初拿多少去切体绩) 01/12 21:17
9F：→ bider:RE用多少量的DNA去反应 01/12 21:17
10F：→ runpapa0520:binding solution的量应该比胶多很多喔 看说明书 01/12 21:19
11F：推 bider:没记错是约1:3 01/12 21:20
嗯嗯 这边我加入bind solution 应该有大於三倍
12F：推 conective:楼上说得没错是胶的3倍体积 01/12 21:26
13F：推 tsubasawolfy:成功率70%?? 这根有没有挑到菌比较相关吧= = 01/12 21:49
挑菌…可是我是用LB直接去养 然後都是同一个菌株养出来的
有时成功 有时失败 没有一个稳定的100%成功 还是我自己的问题?
感谢 提供意见
那怎样才会有再现性 就以抽取DNA与回收胶片的步骤
※ 编辑: syming 来自: 140.113.77.200 (01/12 22:08)
14F：→ ksn:回收胶wash完後column membrane正中央滴入elution 或ddH20, 01/13 00:42
15F：→ ksn:室温静置2~3分钟後再离心。若是DNA後续有clone处理，建议用水 01/13 00:43
16F：→ ksn:唔..kit回收胶片最後wash完，DNA是在membrane上，非Wash buf中 01/13 00:45
17F：→ ksn:看来抽plasmid问题可能一样，kit最後Elution步骤和传统法差异 01/13 00:50
18F：推 enisx:elution那步我都用(放烘箱加热)60度的ddH2O x2次 (建议量减 01/13 08:28
19F：→ enisx:半, 就是说明书要30uL,我会改成15uL两次 01/13 08:29
20F：推 enisx:挑菌是怎麽挑?有可能没挑到吗? 另外LB养得浊浊的不代表就是 01/13 08:32
21F：推 enisx:spin管不要重复用了啦!少一个变因,各家竞争之下也不会太贵!! 01/13 08:36
22F：推 conective:LB应该有加抗生素吧@@? 通常有挑到不太可能出现抽质体 01/13 11:06
23F：→ conective:失败的状况可能有的菌把质体吐掉了 01/13 11:07
24F：→ conective:个人猜测 01/13 11:07
25F：→ iceking:建议你抽完之後,先去测260/280及浓度... 01/13 11:22
26F：推 mtdas:找人带比较快 01/13 13:37
27F：→ Realthugz:杂菌? = = 01/13 20:38
28F：→ Realthugz:菌液浊浊的不一定是喔 我有一次发现不是E.coli... 01/13 20:40
29F：→ Realthugz:有的vector很快被吐掉产量很低 都要重新transform养大量 01/13 20:42
30F：推 icome:mini应该很好抽才对 通常没抽到都是挑到杂菌了 01/14 13:24
31F：→ spirithorse:elute水加温到75度,加个30ul,看要不要静置久一点(1hr) 01/17 23:44
32F：→ spirithorse:有些column烂一点需要久一点时间,原本的plasmid切多点 01/17 23:46