作者airsoda (airsoda)
看板Biotech
標題[求救] zymography做不出來
時間Mon Dec 28 17:18:46 2009
zymograph做不出來...我是用h1299 cell+20%FBS當positive control
我po一下我的步驟
請高人指點~
1.用RIPA抽protein，和2X sample buffer 一比一混合
2.load 20ug的protein跑膠，stacking用5%不含gelatin，
running用10%含1% gelatin，gelatin預溶在水裡。
3.80V跑20分，然後125V跑60分。
4.wash buffer搖50rpm，30分鐘兩次。
5.用reaction buffer搖30分鐘。
6.換掉reaction buffer，37度overnight，coomassive blue染1小時後退染。
目前還沒看到有白band出來過orz
配方:
sample buffer:0.5M Tris-HCL 2.5ml，glycerol 2ml，10% SDS 4ml，
0.1% bromophenol blue 1ml，dd water加到10ml
running buffer:Tris base 2.9g，glycin 14.4g，SDS 1g，dd water 1L，ph 8.3
wash buffer:2.5% triton-x 100 in dd water
reaction buffer: Tris-HCL 50mM，Nacl 0.2M，CaCl2 5mM，dd water 1L，ph 8.0
另外老師問為什麼gelatin不會跑掉的原理? 另外我染完總覺得上層膠顏色比較淡
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.174.158
1F：推 reteporeh:不太懂什麼叫上層膠比較淡..上層膠會去掉阿... 12/28 23:16
2F：→ reteporeh:染一個小時？？我們實驗室都染一天以上@@ 12/28 23:18
3F：推 chinolocal:這個應該沒有差吧~"~我才染20分鐘 12/29 09:50
4F：→ airsoda:running gel的上半部的意思 12/29 10:58
5F：推 msda:我也只染一個小時就有了...記得BUFFER當天泡比較好 12/29 13:31
6F：推 reteporeh:恩恩..大概我家的染劑是便宜貨的關係@@"..不過我以前試 12/29 15:11
7F：→ reteporeh:跑的時候..是拿小鼠的血清來跑..裡面很多MMP-9跟-2 12/29 15:12
8F：→ nerdz:有時訊號不強要stain久一點反差才會出來(把背景弄更深) 12/29 23:54
9F：→ nerdz:1% gelatin會不會太濃? 12/30 00:21