作者airsoda (airsoda)
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标题[求救] zymography做不出来
时间Mon Dec 28 17:18:46 2009
zymograph做不出来...我是用h1299 cell+20%FBS当positive control
我po一下我的步骤
请高人指点~
1.用RIPA抽protein，和2X sample buffer 一比一混合
2.load 20ug的protein跑胶，stacking用5%不含gelatin，
running用10%含1% gelatin，gelatin预溶在水里。
3.80V跑20分，然後125V跑60分。
4.wash buffer摇50rpm，30分钟两次。
5.用reaction buffer摇30分钟。
6.换掉reaction buffer，37度overnight，coomassive blue染1小时後退染。
目前还没看到有白band出来过orz
配方:
sample buffer:0.5M Tris-HCL 2.5ml，glycerol 2ml，10% SDS 4ml，
0.1% bromophenol blue 1ml，dd water加到10ml
running buffer:Tris base 2.9g，glycin 14.4g，SDS 1g，dd water 1L，ph 8.3
wash buffer:2.5% triton-x 100 in dd water
reaction buffer: Tris-HCL 50mM，Nacl 0.2M，CaCl2 5mM，dd water 1L，ph 8.0
另外老师问为什麽gelatin不会跑掉的原理? 另外我染完总觉得上层胶颜色比较淡
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.174.158
1F：推 reteporeh:不太懂什麽叫上层胶比较淡..上层胶会去掉阿... 12/28 23:16
2F：→ reteporeh:染一个小时？？我们实验室都染一天以上@@ 12/28 23:18
3F：推 chinolocal:这个应该没有差吧~"~我才染20分钟 12/29 09:50
4F：→ airsoda:running gel的上半部的意思 12/29 10:58
5F：推 msda:我也只染一个小时就有了...记得BUFFER当天泡比较好 12/29 13:31
6F：推 reteporeh:恩恩..大概我家的染剂是便宜货的关系@@"..不过我以前试 12/29 15:11
7F：→ reteporeh:跑的时候..是拿小鼠的血清来跑..里面很多MMP-9跟-2 12/29 15:12
8F：→ nerdz:有时讯号不强要stain久一点反差才会出来(把背景弄更深) 12/29 23:54
9F：→ nerdz:1% gelatin会不会太浓? 12/30 00:21