作者takumatw (那粒颱風)
看板Biotech
標題Re: [求救] Western Blot出來的band不清楚
時間Thu Dec 24 20:45:28 2009
※ 引述《soceress (贏了世界又如何)》之銘言：
: http://www.wretch.cc/album/show.php?i=steniralc&b=2&f=1288829228&p=0
: 箭頭所指的地方是我的target protein
: blocking是用5% 脫脂奶 1hr
: 一抗是1:1000 ,cell signaling的產品 overnight
: 在5% BSA中稀釋
: 二抗是1:2000 ,Jackson的產品 1hr
: 在5% 脫脂奶中稀釋
: 但呈色後會有點點(如圖),target地方也很不清楚,有水痕
: 本來我一抗是一樣用脫脂奶稀釋,其它都一樣
: 呈色後跟這張圖的問題一樣--target protein很糊,有水痕,但沒有點點
: (所以不是transfer有泡)
: 於是strip後一抗換成datasheet上的5%BSA去稀釋,還是一樣
: 這兩張membrane的其它部份做的band都非常正常,用的buffer也都是一起配的
: 請問這是抗體的問題??
: 還是在染的過程中哪個小細節沒注意到的??
: 請大家賜教~ 感激不盡!!
你這問題我之前遇過,不要再猜了...
1.你二抗用太高，因為二抗太高,訊號一下子就反應光了,不要再提高抗體濃度
二抗用1:10000-15000，一抗就照原廠建議
2.水痕是二抗太高造成的背景，不是transfer的問題，絕對不是!!!!!
你再把cassette上夾membrane的膜再放一便會好依點不過只是治標，治本方式是稀釋二抗
3.二抗請重復使用...不是因為要省錢，是因為效果比較好
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◤龍▃▄▅▄ 我會很有禮貌的 ( ﹎﹎ )
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◆ From: 114.42.207.238
1F：推 tsubasawolfy:印象中jackson的二抗好像都1:10000-1:200000 12/24 21:20
2F：→ tsubasawolfy:原PO的2000的確有點恐怖XD 12/24 21:20
3F：→ tincta:阿？ 我之前2抗都1：3000耶（整本碩論都是），不過沒有遇到 12/24 21:52
4F：→ tincta:像原PO這樣的問題 果然該多學一點 （筆記） 12/24 21:52
5F：推 soceress:真的太感謝了 T_T (筆記下來) 我們Lab之前也是都用1:2000 12/25 09:54
6F：→ soceress:有時會這樣,有時不會 12/25 09:54
7F：→ soceress:今天正好要用到二抗了..... (跪謝~) 12/25 09:55
8F：→ iceking:我二抗用法同1樓 而且只用室溫30分鍾 原po真的太濃了 12/25 11:37
9F：推 icome:不是都一比一萬嗎!? o.O 12/25 11:38
※ 編輯: takumatw 來自: 114.42.79.180 (12/25 20:05)
10F：推 soceress:再次謝謝!!!!!!!! 12/26 12:46