作者takumatw (那粒台风)
看板Biotech
标题Re: [求救] Western Blot出来的band不清楚
时间Thu Dec 24 20:45:28 2009
※ 引述《soceress (赢了世界又如何)》之铭言：
: http://www.wretch.cc/album/show.php?i=steniralc&b=2&f=1288829228&p=0
: 箭头所指的地方是我的target protein
: blocking是用5% 脱脂奶 1hr
: 一抗是1:1000 ,cell signaling的产品 overnight
: 在5% BSA中稀释
: 二抗是1:2000 ,Jackson的产品 1hr
: 在5% 脱脂奶中稀释
: 但呈色後会有点点(如图),target地方也很不清楚,有水痕
: 本来我一抗是一样用脱脂奶稀释,其它都一样
: 呈色後跟这张图的问题一样--target protein很糊,有水痕,但没有点点
: (所以不是transfer有泡)
: 於是strip後一抗换成datasheet上的5%BSA去稀释,还是一样
: 这两张membrane的其它部份做的band都非常正常,用的buffer也都是一起配的
: 请问这是抗体的问题??
: 还是在染的过程中哪个小细节没注意到的??
: 请大家赐教~ 感激不尽!!
你这问题我之前遇过,不要再猜了...
1.你二抗用太高，因为二抗太高,讯号一下子就反应光了,不要再提高抗体浓度
二抗用1:10000-15000，一抗就照原厂建议
2.水痕是二抗太高造成的背景，不是transfer的问题，绝对不是!!!!!
你再把cassette上夹membrane的膜再放一便会好依点不过只是治标，治本方式是稀释二抗
3.二抗请重复使用...不是因为要省钱，是因为效果比较好
--
◤ ╭
● 叫我胡子就好了 ＿(
▁)
▁
◤龙▃▄▅▄ 我会很有礼貌的 ( ﹎﹎ )
§ ● ● ╯ ＝ ＝ │
◣ ︶ ◣─ ◢
─ ◥◤) ψmroscar ╰斗╯
◢ | |
三明书局-你所不知道的关二哥 ◥
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.42.207.238
1F：推 tsubasawolfy:印象中jackson的二抗好像都1:10000-1:200000 12/24 21:20
2F：→ tsubasawolfy:原PO的2000的确有点恐怖XD 12/24 21:20
3F：→ tincta:阿？ 我之前2抗都1：3000耶（整本硕论都是），不过没有遇到 12/24 21:52
4F：→ tincta:像原PO这样的问题 果然该多学一点 （笔记） 12/24 21:52
5F：推 soceress:真的太感谢了 T_T (笔记下来) 我们Lab之前也是都用1:2000 12/25 09:54
6F：→ soceress:有时会这样,有时不会 12/25 09:54
7F：→ soceress:今天正好要用到二抗了..... (跪谢~) 12/25 09:55
8F：→ iceking:我二抗用法同1楼 而且只用室温30分锺 原po真的太浓了 12/25 11:37
9F：推 icome:不是都一比一万吗!? o.O 12/25 11:38
※ 编辑: takumatw 来自: 114.42.79.180 (12/25 20:05)
10F：推 soceress:再次谢谢!!!!!!!! 12/26 12:46