作者soceress (贏了世界又如何)
看板Biotech
標題[求救] Western Blot出來的band不清楚
時間Wed Dec 23 10:17:54 2009
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=steniralc&b=2&f=1288829228&p=0
箭頭所指的地方是我的target protein
blocking是用5% 脫脂奶 1hr
一抗是1:1000 ,cell signaling的產品 overnight
在5% BSA中稀釋
二抗是1:2000 ,Jackson的產品 1hr
在5% 脫脂奶中稀釋
但呈色後會有點點(如圖),target地方也很不清楚,有水痕
本來我一抗是一樣用脫脂奶稀釋,其它都一樣
呈色後跟這張圖的問題一樣--target protein很糊,有水痕,但沒有點點
(所以不是transfer有泡)
於是strip後一抗換成datasheet上的5%BSA去稀釋,還是一樣
這兩張membrane的其它部份做的band都非常正常,用的buffer也都是一起配的
請問這是抗體的問題??
還是在染的過程中哪個小細節沒注意到的??
請大家賜教~ 感激不盡!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.93.160
1F：→ saviora:transfer時氣泡要弄乾淨 12/23 12:01
2F：→ saviora:不好意思搞錯 12/23 12:06
3F：推 raphby:一般一抗跟二抗的skim milk為1%，太高有時候背景很雜 12/23 12:57
4F：→ soceress:嗯..所以有的抗體可以用到5%,如果不行就改用1%試看看囉? 12/23 13:47
5F：→ cyin592:會是ab訊號太弱嗎? 如果1抗先室溫1hr再overnight呢? 12/23 16:57
6F：→ cyin592:室溫會提高1抗的結合率(但若是磷酸化的ab就不建議這樣做) 12/23 16:58
7F：→ pytforyou:我覺得有可能是 Ab 太弱，可以試試配濃一點，例如： 12/23 20:15
8F：→ pytforyou:1:500 之類的～或是把 lysate loading 多一點試試 12/23 20:15
9F：推 zarate:0.5% bsa 4度C blocking 30min 上抗也是0.5% bsa 4度C O/N 12/23 22:37
10F：→ zarate:二抗 用脫脂奶1-3% 可以加量 室溫 1 hr 看看 12/23 22:38
11F：→ zarate:cell signal的抗體 很吃4度C blocking 上一抗 二抗隨便 12/23 22:38
12F：→ zarate:做了MAPK 等等很多支他們家抗體的心得 試試看 12/23 22:39
13F：→ zarate:這家的strip掉要重上 效果不好 所以只有一發子彈 可能多試 12/23 22:40
14F：→ zarate:條件看看 加油 12/23 22:40
15F：→ kemmy:這些白點很明顯的就是 transfer 的氣泡... 12/24 09:32
16F：→ soceress:感謝大家的指點!我今天會試看看!! 給樓上:這張圖是strip 12/24 09:34
17F：→ soceress:後上抗體,第一次用時無白點,故不是transfer時造成的泡 12/24 09:35