作者soceress (赢了世界又如何)
看板Biotech
标题[求救] Western Blot出来的band不清楚
时间Wed Dec 23 10:17:54 2009
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=steniralc&b=2&f=1288829228&p=0
箭头所指的地方是我的target protein
blocking是用5% 脱脂奶 1hr
一抗是1:1000 ,cell signaling的产品 overnight
在5% BSA中稀释
二抗是1:2000 ,Jackson的产品 1hr
在5% 脱脂奶中稀释
但呈色後会有点点(如图),target地方也很不清楚,有水痕
本来我一抗是一样用脱脂奶稀释,其它都一样
呈色後跟这张图的问题一样--target protein很糊,有水痕,但没有点点
(所以不是transfer有泡)
於是strip後一抗换成datasheet上的5%BSA去稀释,还是一样
这两张membrane的其它部份做的band都非常正常,用的buffer也都是一起配的
请问这是抗体的问题??
还是在染的过程中哪个小细节没注意到的??
请大家赐教~ 感激不尽!!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.93.160
1F：→ saviora:transfer时气泡要弄乾净 12/23 12:01
2F：→ saviora:不好意思搞错 12/23 12:06
3F：推 raphby:一般一抗跟二抗的skim milk为1%，太高有时候背景很杂 12/23 12:57
4F：→ soceress:嗯..所以有的抗体可以用到5%,如果不行就改用1%试看看罗? 12/23 13:47
5F：→ cyin592:会是ab讯号太弱吗? 如果1抗先室温1hr再overnight呢? 12/23 16:57
6F：→ cyin592:室温会提高1抗的结合率(但若是磷酸化的ab就不建议这样做) 12/23 16:58
7F：→ pytforyou:我觉得有可能是 Ab 太弱，可以试试配浓一点，例如： 12/23 20:15
8F：→ pytforyou:1:500 之类的～或是把 lysate loading 多一点试试 12/23 20:15
9F：推 zarate:0.5% bsa 4度C blocking 30min 上抗也是0.5% bsa 4度C O/N 12/23 22:37
10F：→ zarate:二抗 用脱脂奶1-3% 可以加量 室温 1 hr 看看 12/23 22:38
11F：→ zarate:cell signal的抗体 很吃4度C blocking 上一抗 二抗随便 12/23 22:38
12F：→ zarate:做了MAPK 等等很多支他们家抗体的心得 试试看 12/23 22:39
13F：→ zarate:这家的strip掉要重上 效果不好 所以只有一发子弹 可能多试 12/23 22:40
14F：→ zarate:条件看看 加油 12/23 22:40
15F：→ kemmy:这些白点很明显的就是 transfer 的气泡... 12/24 09:32
16F：→ soceress:感谢大家的指点!我今天会试看看!! 给楼上:这张图是strip 12/24 09:34
17F：→ soceress:後上抗体,第一次用时无白点,故不是transfer时造成的泡 12/24 09:35