作者FENOR (FENOR)
看板Biotech
標題[求救] ligation的問題
時間Mon Dec 21 14:19:51 2009
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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小弟我做的是將一條920bp的片段接到PET32a(5900bp)裡面，
切位是EcoRI Xho1，
但是做digestion check的時候，卻發現出來的兩條band，
都很明顯的比insert和vector要大很多，甚至還比那兩個加起來都還要大@@
求救，這情況已經發生過好幾次了，上次好不容易做出來，沒想到這次又再發生了> <
有沒有知道這是怎麼一回事啊?
我在ligation之前有跑過膠，確定insert和vector是我要的東西，
但是在做完transform挑菌後，整個都不對。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.125.84
1F：推 ranilla:我猜是vector互黏，vector確實做好CIP的處理，或拉高 12/21 14:51
2F：→ ranilla:insert的比例 12/21 14:51
3F：推 tsubasawolfy:兩個ori的plasmid會複製? 12/21 14:53
4F：→ tsubasawolfy:我覺得要先確認comptent cell有沒有被汙染吧 12/21 14:54
5F：→ FENOR:和學長姐用的是同一批competent cells 但學長姐們沒有問題 12/21 14:58
6F：→ FENOR:我insert和vector的比例，體積比5:1 但總量的比沒定量= = 12/21 14:59
7F：推 ranilla:如果一開始你拿等量的DNA，elute相同體積，照你的作法 12/21 16:39
8F：→ ranilla:這樣充其量V:I不過1:1而已y 12/21 16:40
9F：→ ranilla:SORRY,上面算錯 12/21 16:57
10F：推 DoubleFlower:原po你的colony都挑完了嗎要不要再多挑幾個切切看 12/21 17:38
11F：→ DoubleFlower:我之前做TA cloning時也有遇到類似的狀況 不過多挑幾 12/21 17:40
12F：→ DoubleFlower:還是有切出我預期的size 12/21 17:42
13F：→ FENOR:我再多挑幾個試試看好了......這次加uncut control試試看 12/21 18:46
14F：→ ranilla:一個plasmid確實不能有相同的兩個origin 12/21 20:37