作者FENOR (FENOR)
看板Biotech
标题[求救] ligation的问题
时间Mon Dec 21 14:19:51 2009
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
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小弟我做的是将一条920bp的片段接到PET32a(5900bp)里面，
切位是EcoRI Xho1，
但是做digestion check的时候，却发现出来的两条band，
都很明显的比insert和vector要大很多，甚至还比那两个加起来都还要大@@
求救，这情况已经发生过好几次了，上次好不容易做出来，没想到这次又再发生了> <
有没有知道这是怎麽一回事啊?
我在ligation之前有跑过胶，确定insert和vector是我要的东西，
但是在做完transform挑菌後，整个都不对。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.125.84
1F：推 ranilla:我猜是vector互黏，vector确实做好CIP的处理，或拉高 12/21 14:51
2F：→ ranilla:insert的比例 12/21 14:51
3F：推 tsubasawolfy:两个ori的plasmid会复制? 12/21 14:53
4F：→ tsubasawolfy:我觉得要先确认comptent cell有没有被污染吧 12/21 14:54
5F：→ FENOR:和学长姐用的是同一批competent cells 但学长姐们没有问题 12/21 14:58
6F：→ FENOR:我insert和vector的比例，体积比5:1 但总量的比没定量= = 12/21 14:59
7F：推 ranilla:如果一开始你拿等量的DNA，elute相同体积，照你的作法 12/21 16:39
8F：→ ranilla:这样充其量V:I不过1:1而已y 12/21 16:40
9F：→ ranilla:SORRY,上面算错 12/21 16:57
10F：推 DoubleFlower:原po你的colony都挑完了吗要不要再多挑几个切切看 12/21 17:38
11F：→ DoubleFlower:我之前做TA cloning时也有遇到类似的状况 不过多挑几 12/21 17:40
12F：→ DoubleFlower:还是有切出我预期的size 12/21 17:42
13F：→ FENOR:我再多挑几个试试看好了......这次加uncut control试试看 12/21 18:46
14F：→ ranilla:一个plasmid确实不能有相同的两个origin 12/21 20:37