※ 引述《ATPase ( o_o)》之銘言： : 我要看的蛋白在膜上 大小是170-190 : 這是一個很長的故事= = : 總之一開始壓片出來整個是白的 猜想是沒有transfer過去 : 所以我4。C transfer overnight : 就看得到了 : 可是目前就是髒髒醜醜的 : 趨勢若有似無 有蠻多雜band... : 我還寫信問抗體公司(cell signaling) : 他給我的建議是 : 1.膜蛋白煮沸容易聚合(?) 叫我不要95度 5min : 以60-70度15-20min代替 來處裡sample : 2.並且用"牛奶"blocking : 3.而抗體的稀釋建議以PBS 或TBS 就好 不要加BSA 跟 TWEEN20 : 可是看起來也是黑黑髒髒的 : 而且 要明顯的話 就要曝光好幾分鐘才看得到 : 但是曝光久背景值也好高 根本就很髒 : 如果我想拉開點(已經用到6% 的膠 跑50V 了喔= = ) : band就會糊掉或歪掉 : 想直直的就會拉不開 囧 : 我剛剛爬了許多文 : 發現有人建議大分子量的蛋白在transfer時 : transfer buffer 可以加0.1%的SDS 而methenol則由20降到10% : 以及乾脆用全細胞跑 以免離心後膜蛋白所剩無幾 : (我試過一次 覺得蛋白質定量好像會誤差很大 : 而且loading時很糊很黏根本load不下去) : 想請教各位大大 覺得如果我這樣處理DATA會不會好一些 : 我已經鬼打牆一個多月了 : 現在剩不到一個月可以補DATA : 阿阿阿 一定要跑出一個漂亮一點的圖啊Orz : 麻煩大家給我一點意見吧 >_< : 謝謝Orz 因為怕推文的大家會沒有注意到 其實我是要上來感謝大家的幫忙啦 >///< (羞) 我把DATA都補出來了 這兩天終於睡得飽飽的了 ^_^Y 感謝各位板友無私的分享~~~ 結果我完全不煮 直接靜置後就跑膠(8%) 雖然不是完全乾淨 可是調整一下圖看起來就OK了 blocking用牛奶 一抗是用PBS泡的(1:2000) 二抗 1:5000 in PBST 只是我洗的時候有特別增加時間 一抗後 15min x 4 time 二抗後 15min X 3 time +30min x 2 Time (而且我的PBST還是 0.2% 的喔~) 在此對幫忙我的版友獻上感恩啊!!!! --

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