※ 引述《ATPase ( o_o)》之铭言： : 我要看的蛋白在膜上 大小是170-190 : 这是一个很长的故事= = : 总之一开始压片出来整个是白的 猜想是没有transfer过去 : 所以我4。C transfer overnight : 就看得到了 : 可是目前就是脏脏丑丑的 : 趋势若有似无 有蛮多杂band... : 我还写信问抗体公司(cell signaling) : 他给我的建议是 : 1.膜蛋白煮沸容易聚合(?) 叫我不要95度 5min : 以60-70度15-20min代替 来处里sample : 2.并且用"牛奶"blocking : 3.而抗体的稀释建议以PBS 或TBS 就好 不要加BSA 跟 TWEEN20 : 可是看起来也是黑黑脏脏的 : 而且 要明显的话 就要曝光好几分钟才看得到 : 但是曝光久背景值也好高 根本就很脏 : 如果我想拉开点(已经用到6% 的胶 跑50V 了喔= = ) : band就会糊掉或歪掉 : 想直直的就会拉不开 囧 : 我刚刚爬了许多文 : 发现有人建议大分子量的蛋白在transfer时 : transfer buffer 可以加0.1%的SDS 而methenol则由20降到10% : 以及乾脆用全细胞跑 以免离心後膜蛋白所剩无几 : (我试过一次 觉得蛋白质定量好像会误差很大 : 而且loading时很糊很黏根本load不下去) : 想请教各位大大 觉得如果我这样处理DATA会不会好一些 : 我已经鬼打墙一个多月了 : 现在剩不到一个月可以补DATA : 阿阿阿 一定要跑出一个漂亮一点的图啊Orz : 麻烦大家给我一点意见吧 >_< : 谢谢Orz 因为怕推文的大家会没有注意到 其实我是要上来感谢大家的帮忙啦 >///< (羞) 我把DATA都补出来了 这两天终於睡得饱饱的了 ^_^Y 感谢各位板友无私的分享~~~ 结果我完全不煮 直接静置後就跑胶(8%) 虽然不是完全乾净 可是调整一下图看起来就OK了 blocking用牛奶 一抗是用PBS泡的(1:2000) 二抗 1:5000 in PBST 只是我洗的时候有特别增加时间 一抗後 15min x 4 time 二抗後 15min X 3 time +30min x 2 Time (而且我的PBST还是 0.2% 的喔~) 在此对帮忙我的版友献上感恩啊!!!! --

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