作者chaunen (Magic Ha)
看板Biotech
標題[求救] cPCR有東西, 卻養不出小量
時間Mon Dec 7 23:51:01 2009
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----
1. 用primer夾出target gene,跑 2% agarose gel. 確定target gene有被放大.
2. 做T/A clone, 使用promega的系統, inser(8.6ng),vector(25ng) (inser:~1.8kb)
(pGEM-T Easy Vector system, 帶有anti-ampicillin的gene)
3. ligation overnight後, transform到DH5a裡(heat shock:90sec, on ice: 30mins)
4. 加入500ul LB後, 於37度烘箱搖1hr. 之後取250ul塗盤(ampiillin: 100ug/ml)
5. 37度烘箱中培養14~16hr後, 挑菌做cPCR, 養小量(ampicillin: 100ug/ml)
6. 37度烘箱中搖14~16hr. 菌液依然清澈透明 "Orz
問題: 確定cPCR有我要的inser(表示有plasmid在), 可是卻養不出小量(菌液清澈透明)?
已經確定PCR system沒有被污染, ampicillin也是新鮮的.
P.S 第一次PO文, 有哪裡講不清楚的請提出, 我會再補上.
先謝謝各位了!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.77.148
※ 編輯: chaunen 來自: 140.129.77.148 (12/07 23:54)
※ 編輯: chaunen 來自: 140.129.77.148 (12/07 23:57)
1F：推 bider:Amp plate可否做control看是否抗生素真的有效? 12/08 01:22
2F：→ bider:另外 PCR有做negative control確定沒有template情況下 12/08 01:24
3F：→ bider:也沒有產物嗎 12/08 01:24
4F：推 singren:ligation, heat shock跟冷卻的時間好像都有點久.. 12/08 10:55
5F：→ singren:我之前做是ligation 30min,heat shock 45s, ice 5min 12/08 10:57
6F：推 singren:還有polymerase是用什麼? 怎麼知道尾端有沒有接上A 12/08 11:00
7F：推 Fourfish:cPCR偽陽性高 如果我是你的話 重做比較快... 12/08 12:52
8F：推 honny7410:同意一樓，先確認你的Amp plate效果是否還在 12/08 19:17
9F：→ chaunen:結果真的是plate amp失效 cPCR的negtive control也做了 12/14 01:48
10F：→ chaunen:cPCR的偽陽性還真不少 XD 我太相信cPCR了ˊˋ 12/14 01:49
11F：→ chaunen:抽出來的plasmid好像會有aggregate的問題 12/14 01:51
12F：→ chaunen:size約在8~10K (vector + inser大約5K) 12/14 01:51
13F：→ chaunen:不過切下inser的話, 又可以看到正常的band 12/14 01:52
14F：→ chaunen:vector:3K inser:1.8K 12/14 01:53
15F：→ chaunen:不論如何還是謝謝大家! (我也太晚回了=.=") 12/14 01:54