作者chaunen (Magic Ha)
看板Biotech
标题[求救] cPCR有东西, 却养不出小量
时间Mon Dec 7 23:51:01 2009
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
1. 用primer夹出target gene,跑 2% agarose gel. 确定target gene有被放大.
2. 做T/A clone, 使用promega的系统, inser(8.6ng),vector(25ng) (inser:~1.8kb)
(pGEM-T Easy Vector system, 带有anti-ampicillin的gene)
3. ligation overnight後, transform到DH5a里(heat shock:90sec, on ice: 30mins)
4. 加入500ul LB後, 於37度烘箱摇1hr. 之後取250ul涂盘(ampiillin: 100ug/ml)
5. 37度烘箱中培养14~16hr後, 挑菌做cPCR, 养小量(ampicillin: 100ug/ml)
6. 37度烘箱中摇14~16hr. 菌液依然清澈透明 "Orz
问题: 确定cPCR有我要的inser(表示有plasmid在), 可是却养不出小量(菌液清澈透明)?
已经确定PCR system没有被污染, ampicillin也是新鲜的.
P.S 第一次PO文, 有哪里讲不清楚的请提出, 我会再补上.
先谢谢各位了!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.77.148
※ 编辑: chaunen 来自: 140.129.77.148 (12/07 23:54)
※ 编辑: chaunen 来自: 140.129.77.148 (12/07 23:57)
1F：推 bider:Amp plate可否做control看是否抗生素真的有效? 12/08 01:22
2F：→ bider:另外 PCR有做negative control确定没有template情况下 12/08 01:24
3F：→ bider:也没有产物吗 12/08 01:24
4F：推 singren:ligation, heat shock跟冷却的时间好像都有点久.. 12/08 10:55
5F：→ singren:我之前做是ligation 30min,heat shock 45s, ice 5min 12/08 10:57
6F：推 singren:还有polymerase是用什麽? 怎麽知道尾端有没有接上A 12/08 11:00
7F：推 Fourfish:cPCR伪阳性高 如果我是你的话 重做比较快... 12/08 12:52
8F：推 honny7410:同意一楼，先确认你的Amp plate效果是否还在 12/08 19:17
9F：→ chaunen:结果真的是plate amp失效 cPCR的negtive control也做了 12/14 01:48
10F：→ chaunen:cPCR的伪阳性还真不少 XD 我太相信cPCR了ˊˋ 12/14 01:49
11F：→ chaunen:抽出来的plasmid好像会有aggregate的问题 12/14 01:51
12F：→ chaunen:size约在8~10K (vector + inser大约5K) 12/14 01:51
13F：→ chaunen:不过切下inser的话, 又可以看到正常的band 12/14 01:52
14F：→ chaunen:vector:3K inser:1.8K 12/14 01:53
15F：→ chaunen:不论如何还是谢谢大家! (我也太晚回了=.=") 12/14 01:54