作者molkna (孟克的吶喊)
看板Biotech
標題[求救] Pichia pastoris系統表現蛋白
時間Wed Nov 25 15:41:43 2009
大家好，
我目前在使用pichia pastoris表現系統表現病毒蛋白，
使用的vector是pGAPZa加上SMD1168 stain的酵母菌，
電穿孔後有挑到能生長在高抗生素的培養基上(Zeocin 2000ug/ml)，
但拿來表現蛋白後，不論是取100倍濃縮的上清液或是用玻璃珠打pellet，
Westen blot都偵測不到。
培養條件是30度，270rpm搖兩到三天，
收取上清液濃縮100倍，
Flask是燒凹角的三角錐形瓶(增加震盪)，
不知道有沒有在做相關研究的板友，
可站內信討論，相當感激!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.109.67
1F：推 littlelizard:請問你用的培養基是...? 還有western的抗體是...? 11/26 12:43
2F：推 raxjimmy:質體上有確實接到基因嗎?有可能選到空質體的菌種 11/26 16:42
3F：→ molkna:我用的是YPD培養基，Westen 抗體用Anti-HIS 或myc下去認 11/26 18:44
4F：→ molkna:跑Westen前都有用colony PCR篩過，都有insert進去，但不知 11/26 18:45
5F：→ molkna:道為什麼，到產蛋白就卡住了>_<" 11/26 18:46
6F：推 littlelizard:果然阿...甲醇誘導的時候如果培養基裡有glucose會抑 11/28 17:06
7F：→ littlelizard:制AOXp啟動下游基因表現 建議你誘導時置換成YPM 11/28 17:07
8F：→ littlelizard:然後你可以去看一本書 Pichia Protocol 對實驗有幫助 11/28 17:08
9F：→ molkna:感謝建議，不過我用的是pGAPZ的載體，應該是不需要甲醇 11/30 20:26
10F：→ molkna:下去誘導的，這個載體是使用GAP為起動子。 11/30 20:28
11F：→ molkna:但適用哪一種培養基適合產蛋白這我的確不大清楚，我再試試 11/30 20:31
12F：→ molkna:看，謝謝! 11/30 20:31
13F：推 littlelizard:抱歉我眼花了 @@ 12/02 00:35