作者molkna (孟克的呐喊)
看板Biotech
标题[求救] Pichia pastoris系统表现蛋白
时间Wed Nov 25 15:41:43 2009
大家好，
我目前在使用pichia pastoris表现系统表现病毒蛋白，
使用的vector是pGAPZa加上SMD1168 stain的酵母菌，
电穿孔後有挑到能生长在高抗生素的培养基上(Zeocin 2000ug/ml)，
但拿来表现蛋白後，不论是取100倍浓缩的上清液或是用玻璃珠打pellet，
Westen blot都侦测不到。
培养条件是30度，270rpm摇两到三天，
收取上清液浓缩100倍，
Flask是烧凹角的三角锥形瓶(增加震荡)，
不知道有没有在做相关研究的板友，
可站内信讨论，相当感激!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.109.67
1F：推 littlelizard:请问你用的培养基是...? 还有western的抗体是...? 11/26 12:43
2F：推 raxjimmy:质体上有确实接到基因吗?有可能选到空质体的菌种 11/26 16:42
3F：→ molkna:我用的是YPD培养基，Westen 抗体用Anti-HIS 或myc下去认 11/26 18:44
4F：→ molkna:跑Westen前都有用colony PCR筛过，都有insert进去，但不知 11/26 18:45
5F：→ molkna:道为什麽，到产蛋白就卡住了>_<" 11/26 18:46
6F：推 littlelizard:果然阿...甲醇诱导的时候如果培养基里有glucose会抑 11/28 17:06
7F：→ littlelizard:制AOXp启动下游基因表现 建议你诱导时置换成YPM 11/28 17:07
8F：→ littlelizard:然後你可以去看一本书 Pichia Protocol 对实验有帮助 11/28 17:08
9F：→ molkna:感谢建议，不过我用的是pGAPZ的载体，应该是不需要甲醇 11/30 20:26
10F：→ molkna:下去诱导的，这个载体是使用GAP为起动子。 11/30 20:28
11F：→ molkna:但适用哪一种培养基适合产蛋白这我的确不大清楚，我再试试 11/30 20:31
12F：→ molkna:看，谢谢! 11/30 20:31
13F：推 littlelizard:抱歉我眼花了 @@ 12/02 00:35