作者ATPase ( o_o)
看板Biotech
標題[求救] 高分子量的膜蛋白跑 SDS_PAGE
時間Tue Nov 24 12:04:06 2009
我要看的蛋白在膜上 大小是170-190
這是一個很長的故事= =
總之一開始壓片出來整個是白的 猜想是沒有transfer過去
所以我4。C transfer overnight
就看得到了
可是目前就是髒髒醜醜的
趨勢若有似無 有蠻多雜band...
我還寫信問抗體公司(cell signaling)
他給我的建議是
1.膜蛋白煮沸容易聚合(?) 叫我不要95度 5min
以60-70度15-20min代替 來處裡sample
2.並且用"牛奶"blocking
3.而抗體的稀釋建議以PBS 或TBS 就好 不要加BSA 跟 TWEEN20
可是看起來也是黑黑髒髒的
而且 要明顯的話 就要曝光好幾分鐘才看得到
但是曝光久背景值也好高 根本就很髒
如果我想拉開點(已經用到6% 的膠 跑50V 了喔= = )
band就會糊掉或歪掉
想直直的就會拉不開 囧
我剛剛爬了許多文
發現有人建議大分子量的蛋白在transfer時
transfer buffer 可以加0.1%的SDS 而methenol則由20降到10%
以及乾脆用全細胞跑 以免離心後膜蛋白所剩無幾
(我試過一次 覺得蛋白質定量好像會誤差很大
而且loading時很糊很黏根本load不下去)
想請教各位大大 覺得如果我這樣處理DATA會不會好一些
我已經鬼打牆一個多月了
現在剩不到一個月可以補DATA
阿阿阿 一定要跑出一個漂亮一點的圖啊Orz
麻煩大家給我一點意見吧 >_<
謝謝Orz
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◆ From: 140.109.223.184
※ 編輯: ATPase 來自: 140.109.223.184 (11/24 12:13)
1F：→ reinherd:我有一樣的問題 也是問cell signaling 但是他們給我的建 11/24 13:37
2F：→ reinherd:意是用sonication破壞膜結構 你可以試看看 我還沒試 11/24 13:38
3F：→ reinherd:我是看E-cadherin 135kd 11/24 13:38
4F：→ reinherd:不然就是我最近在思考在lysis buffer裡面加triton x100 11/24 13:39
5F：→ reinherd:因為我做con-focal的sample preparation會用此來permeabl 11/24 13:40
6F：→ reinherd:ize膜我當時有跟support講不過他們還是說sonication最好 11/24 13:41
7F：→ ATPase:E-cadherin我有做過耶 其實不用sonicate 我都是刮完細胞 11/24 14:03
8F：→ ATPase:裝進各管後 votex久一點 就OK了 11/24 14:03
9F：→ ATPase:不過lysis buffer可以換強一點的 detergent多一點的 11/24 14:04
10F：→ ATPase:甚至用10% gel 跑久一點都還可以 不過用8%也許比較好 11/24 14:05
11F：推 reinherd:我曾經聽樓上的postdoc說膜蛋白有些要用專門kit 11/24 14:07
12F：→ ATPase:我找的一些paper裡也有這樣說耶 好像是要enrich膜蛋白用的 11/24 14:13
13F：推 egoweaver:借題問一下，如果跑出來髒的話不是表示non-specific 11/24 14:45
14F：→ egoweaver:binding多嗎？為什麼反而把稀釋抗體的BSA和detergent拿 11/24 14:45
15F：→ egoweaver:掉呢？這樣不是應該會使band更髒嗎… 11/24 14:46
16F：→ ATPase:這個問題我也想過= = 因為我是壓片壓很久搞的背景高的要死 11/24 14:54
17F：→ ATPase:也許他是希望signal強一點 再讓我洗久一點吧Orz(誤) 11/24 14:56
18F：推 vandia:哈~我做的東西就是樓上耶,我確定有純化膜的kit,不過我沒買 11/24 22:06
19F：→ vandia:我的建議是lysis後冰-80一陣子再離心,還有transfer久一點 11/24 22:08
20F：→ vandia:之前做一個蛋白質分子量大概也是170,要比另外兩個100左右 11/24 22:08
21F：→ vandia:多transfer5分鐘(semi-dry,biorad) 11/24 22:09
22F：推 vandia:另外我抗體稀釋也不加detergent,wash才用PBST,背景值都OK 11/24 22:11
23F：→ vandia:ps.我們LAB是取組織,萃取用sonicator震到不見組織為止 11/24 22:13
24F：推 reinherd:髒不代表non-specific binding多 可能是你signal太低 11/25 02:45
25F：→ reinherd:所以背景看起來很強 原因可能很多種 11/25 02:45
26F：推 xenosdk:我們實驗室跑ABCA1是不加熱 直接跑 一加熱就掛.. 11/25 10:37
27F：→ ATPase:一加熱就掛是指說會變超髒嗎>< 11/25 11:20
28F：推 vandia:我們家也有一隻不能加熱的,加熱之後會染到很多條band 11/25 22:03
29F：→ vandia:直接加dye靜置5-10分鐘就load了 11/25 22:04
30F：→ vandia:不能加熱的是hb的sodium pump 11/25 22:05
31F：→ ATPase:那....你們有在dye跟running buffer裡多加SDS嗎??? 11/26 19:25
32F：→ ATPase:還是用原本的配方 只是不加熱??? 11/26 19:26
33F：推 xenosdk:配方都一樣就是不加熱而以, 膜蛋白是很神其很詭異的.. 11/27 08:09
34F：→ xenosdk:原PO加油吧... 11/27 08:09
35F：→ ATPase:感謝.... 我會試試看的Orz 11/28 13:53
36F：→ june0101:也許你需要native page 查查吧 12/09 00:00