作者ATPase ( o_o)
看板Biotech
标题[求救] 高分子量的膜蛋白跑 SDS_PAGE
时间Tue Nov 24 12:04:06 2009
我要看的蛋白在膜上 大小是170-190
这是一个很长的故事= =
总之一开始压片出来整个是白的 猜想是没有transfer过去
所以我4。C transfer overnight
就看得到了
可是目前就是脏脏丑丑的
趋势若有似无 有蛮多杂band...
我还写信问抗体公司(cell signaling)
他给我的建议是
1.膜蛋白煮沸容易聚合(?) 叫我不要95度 5min
以60-70度15-20min代替 来处里sample
2.并且用"牛奶"blocking
3.而抗体的稀释建议以PBS 或TBS 就好 不要加BSA 跟 TWEEN20
可是看起来也是黑黑脏脏的
而且 要明显的话 就要曝光好几分钟才看得到
但是曝光久背景值也好高 根本就很脏
如果我想拉开点(已经用到6% 的胶 跑50V 了喔= = )
band就会糊掉或歪掉
想直直的就会拉不开 囧
我刚刚爬了许多文
发现有人建议大分子量的蛋白在transfer时
transfer buffer 可以加0.1%的SDS 而methenol则由20降到10%
以及乾脆用全细胞跑 以免离心後膜蛋白所剩无几
(我试过一次 觉得蛋白质定量好像会误差很大
而且loading时很糊很黏根本load不下去)
想请教各位大大 觉得如果我这样处理DATA会不会好一些
我已经鬼打墙一个多月了
现在剩不到一个月可以补DATA
阿阿阿 一定要跑出一个漂亮一点的图啊Orz
麻烦大家给我一点意见吧 >_<
谢谢Orz
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.223.184
※ 编辑: ATPase 来自: 140.109.223.184 (11/24 12:13)
1F：→ reinherd:我有一样的问题 也是问cell signaling 但是他们给我的建 11/24 13:37
2F：→ reinherd:意是用sonication破坏膜结构 你可以试看看 我还没试 11/24 13:38
3F：→ reinherd:我是看E-cadherin 135kd 11/24 13:38
4F：→ reinherd:不然就是我最近在思考在lysis buffer里面加triton x100 11/24 13:39
5F：→ reinherd:因为我做con-focal的sample preparation会用此来permeabl 11/24 13:40
6F：→ reinherd:ize膜我当时有跟support讲不过他们还是说sonication最好 11/24 13:41
7F：→ ATPase:E-cadherin我有做过耶 其实不用sonicate 我都是刮完细胞 11/24 14:03
8F：→ ATPase:装进各管後 votex久一点 就OK了 11/24 14:03
9F：→ ATPase:不过lysis buffer可以换强一点的 detergent多一点的 11/24 14:04
10F：→ ATPase:甚至用10% gel 跑久一点都还可以 不过用8%也许比较好 11/24 14:05
11F：推 reinherd:我曾经听楼上的postdoc说膜蛋白有些要用专门kit 11/24 14:07
12F：→ ATPase:我找的一些paper里也有这样说耶 好像是要enrich膜蛋白用的 11/24 14:13
13F：推 egoweaver:借题问一下，如果跑出来脏的话不是表示non-specific 11/24 14:45
14F：→ egoweaver:binding多吗？为什麽反而把稀释抗体的BSA和detergent拿 11/24 14:45
15F：→ egoweaver:掉呢？这样不是应该会使band更脏吗… 11/24 14:46
16F：→ ATPase:这个问题我也想过= = 因为我是压片压很久搞的背景高的要死 11/24 14:54
17F：→ ATPase:也许他是希望signal强一点 再让我洗久一点吧Orz(误) 11/24 14:56
18F：推 vandia:哈~我做的东西就是楼上耶,我确定有纯化膜的kit,不过我没买 11/24 22:06
19F：→ vandia:我的建议是lysis後冰-80一阵子再离心,还有transfer久一点 11/24 22:08
20F：→ vandia:之前做一个蛋白质分子量大概也是170,要比另外两个100左右 11/24 22:08
21F：→ vandia:多transfer5分钟(semi-dry,biorad) 11/24 22:09
22F：推 vandia:另外我抗体稀释也不加detergent,wash才用PBST,背景值都OK 11/24 22:11
23F：→ vandia:ps.我们LAB是取组织,萃取用sonicator震到不见组织为止 11/24 22:13
24F：推 reinherd:脏不代表non-specific binding多 可能是你signal太低 11/25 02:45
25F：→ reinherd:所以背景看起来很强 原因可能很多种 11/25 02:45
26F：推 xenosdk:我们实验室跑ABCA1是不加热 直接跑 一加热就挂.. 11/25 10:37
27F：→ ATPase:一加热就挂是指说会变超脏吗>< 11/25 11:20
28F：推 vandia:我们家也有一只不能加热的,加热之後会染到很多条band 11/25 22:03
29F：→ vandia:直接加dye静置5-10分钟就load了 11/25 22:04
30F：→ vandia:不能加热的是hb的sodium pump 11/25 22:05
31F：→ ATPase:那....你们有在dye跟running buffer里多加SDS吗??? 11/26 19:25
32F：→ ATPase:还是用原本的配方 只是不加热??? 11/26 19:26
33F：推 xenosdk:配方都一样就是不加热而以, 膜蛋白是很神其很诡异的.. 11/27 08:09
34F：→ xenosdk:原PO加油吧... 11/27 08:09
35F：→ ATPase:感谢.... 我会试试看的Orz 11/28 13:53
36F：→ june0101:也许你需要native page 查查吧 12/09 00:00