作者ilovesea (結束了!:D樣)
看板Biotech
標題[求救] 轉殖菌放大培養
時間Mon Nov 23 20:52:53 2009
最近為了這個實驗做不出
來很頭痛
想不出來原因
只好來板上求各位前輩@@
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我的實驗是要從一隻基因轉殖的菌體中將其培養破碎後
得其胞內酵素 進行轉化產生我要的產物
目前大致上的培養流程如下
single colony
↓ 30C, 24hr
10mL flask
↓ 30C, overnight
100mL flask (10mL 搖瓶後OD600約1.6~1.7, 100*0.1/1.7約加入6 mL)
↓ 27 C, 2hr (使其OD達0.5)
3L Bioreactor
培養16~18 hr後 收槽
後續使用27C是由於先前結果顯示低溫使菌體生長慢質體不易變易
此外 IPTG誘導後會使protein形成inclusion body 因此可能無法誘導@@
最先開始在做生長曲線時
有在發酵槽中加入Ampicillin及Chloramphenicol
酵素活性到16小時後趨於穩定
下一次實驗在發酵槽中未加入抗生素
同樣的有活性
因要再次確認
之後就再也做不出有活性了~
有幾次有找出原因
但最近這兩次已經想不到還有什麼原因了
這株基因轉殖菌的資料如下
- Plasmid：pET-23a (+)
- Cloning Host：DH5α (E. coli strains)
- Expression host：Rosetta-GamiB (DE3) (E. coli strains)抗Kan+Tet+Chl
收槽後是以高壓均質機破碎菌體
懇請各位前輩指教@@
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.104.93
※ 編輯: ilovesea 來自: 140.120.104.93 (11/23 20:55)
1F：推 Fourfish:plasmid被踢掉了 重新transform吧 養菌時抗生素不要省 11/23 22:50
2F：→ Fourfish:不好意思 其實忘了先問你的enzyme有表現出來嗎？ 11/23 22:54
3F：→ ilovesea:在 10mL 及 100mL的培養基中 都有加入抗生素 11/23 23:12
4F：→ ilovesea:剛開始做enzyme有表現 但近期實驗卻沒有表現 11/23 23:13
5F：→ ilovesea:若質體真的一開始被踢掉了 為什麼再有抗生素的部分可以 11/23 23:13
6F：→ ilovesea:生長呢@@? 11/23 23:13
7F：推 sheepfeather:有可能transposon跳到chromosome上面 11/23 23:28
8F：→ jsi:此外，有時候plasmid會發生部分片段被踢掉的情況，也可能造成 11/25 02:46
9F：→ jsi:上述情況。 收菌的DNA，用酵素切切看 11/25 02:47
10F：→ ilovesea:先謝謝以上回答 另外我想請問 有可能是轉殖菌株 已經繼代 11/25 08:51
11F：→ ilovesea:多次 而造成他不穩定嘛? 謝謝:) 11/25 08:51
12F：推 Fourfish:回上面問題 會 所以最好每次都重新轉型再表現蛋白 不只繼 11/25 18:25
13F：→ Fourfish:代 有時連凍過再拿來表現都會變差 我之前也遇過這樣的問 11/25 18:25
14F：→ Fourfish:題 重送就改善很多了 另外我是指在發酵槽時沒加抗生素 11/25 18:28
15F：→ ilovesea:謝謝以上~~^^ 12/04 00:31