作者ilovesea (结束了!:D样)
看板Biotech
标题[求救] 转殖菌放大培养
时间Mon Nov 23 20:52:53 2009
最近为了这个实验做不出
来很头痛
想不出来原因
只好来板上求各位前辈@@
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我的实验是要从一只基因转殖的菌体中将其培养破碎後
得其胞内酵素 进行转化产生我要的产物
目前大致上的培养流程如下
single colony
↓ 30C, 24hr
10mL flask
↓ 30C, overnight
100mL flask (10mL 摇瓶後OD600约1.6~1.7, 100*0.1/1.7约加入6 mL)
↓ 27 C, 2hr (使其OD达0.5)
3L Bioreactor
培养16~18 hr後 收槽
後续使用27C是由於先前结果显示低温使菌体生长慢质体不易变易
此外 IPTG诱导後会使protein形成inclusion body 因此可能无法诱导@@
最先开始在做生长曲线时
有在发酵槽中加入Ampicillin及Chloramphenicol
酵素活性到16小时後趋於稳定
下一次实验在发酵槽中未加入抗生素
同样的有活性
因要再次确认
之後就再也做不出有活性了~
有几次有找出原因
但最近这两次已经想不到还有什麽原因了
这株基因转殖菌的资料如下
- Plasmid：pET-23a (+)
- Cloning Host：DH5α (E. coli strains)
- Expression host：Rosetta-GamiB (DE3) (E. coli strains)抗Kan+Tet+Chl
收槽後是以高压均质机破碎菌体
恳请各位前辈指教@@
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.104.93
※ 编辑: ilovesea 来自: 140.120.104.93 (11/23 20:55)
1F：推 Fourfish:plasmid被踢掉了 重新transform吧 养菌时抗生素不要省 11/23 22:50
2F：→ Fourfish:不好意思 其实忘了先问你的enzyme有表现出来吗？ 11/23 22:54
3F：→ ilovesea:在 10mL 及 100mL的培养基中 都有加入抗生素 11/23 23:12
4F：→ ilovesea:刚开始做enzyme有表现 但近期实验却没有表现 11/23 23:13
5F：→ ilovesea:若质体真的一开始被踢掉了 为什麽再有抗生素的部分可以 11/23 23:13
6F：→ ilovesea:生长呢@@? 11/23 23:13
7F：推 sheepfeather:有可能transposon跳到chromosome上面 11/23 23:28
8F：→ jsi:此外，有时候plasmid会发生部分片段被踢掉的情况，也可能造成 11/25 02:46
9F：→ jsi:上述情况。 收菌的DNA，用酵素切切看 11/25 02:47
10F：→ ilovesea:先谢谢以上回答 另外我想请问 有可能是转殖菌株 已经继代 11/25 08:51
11F：→ ilovesea:多次 而造成他不稳定嘛? 谢谢:) 11/25 08:51
12F：推 Fourfish:回上面问题 会 所以最好每次都重新转型再表现蛋白 不只继 11/25 18:25
13F：→ Fourfish:代 有时连冻过再拿来表现都会变差 我之前也遇过这样的问 11/25 18:25
14F：→ Fourfish:题 重送就改善很多了 另外我是指在发酵槽时没加抗生素 11/25 18:28
15F：→ ilovesea:谢谢以上~~^^ 12/04 00:31