作者radan (為了部落!)
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標題[求救] RT-PCR出不來
時間Wed Nov 18 00:09:34 2009
小弟我是用Trizol抽cell line的RNA
目前遇到的困難是抽出來去測RNA濃度和260/280的值都不錯
但是RT-PCR之後跑B2M卻沒東西,我有拿之前轉得出來的RNA當positive control
測過RT,PCR則再拿這個positive control轉完的cDNA加上別人跑過確定有東西的
cDNA來當兩組positive control,最後結果這兩組都有東西,但我的sample還是
連個鬼影子都沒有,請問有大大知道到底是怎麼回事了嗎?
底下附上我整個實驗流程:
cell line:HepG2
-> 10cm dish cell + 1ml trizol
-> 4'C 12000rpm 10mins
-> 取上清液,室溫5mins,+200ul chloroform 輕搖15 secs,室溫3 mins
-> 4'C 12000rpm 10mins
-> 取上清液,+200ul isopropanol,室溫5 mins
-> 4'C 12000rpm 10mins
-> 吸掉液體,+1ml 75% Ethanol wash pallete
-> 4'c 9000rpm 10mins
-> 去除Ethanol,將pallete air dry
-> +DEPC水20ul,測RNA濃度
-> Hep G2 : 2859.6ng/ul 260/280:1.95 260/230:2.03
-> RT步驟:DEPC水+dNTP+oligo dT+RNA=13ul
->65'C 5mins , 4'C 1mins , +5X buffer 4ul和0.1M DTT 2ul
->37'C 5mins , +1ul MMLV
->37'C 50 mins , 70'C 15mins
-> PCR步驟:DEPC水39.5ul+dNTP2ul+10X buffer 2ul+primer 2ul+cDNA2ul+Tag0.5
ul
->95'C 30secs , 58'C(B2M primer)30secs , 72'C 30secs , 35 cycle
72'C 10mins
-> 8ul產物跑膠
以上就是我整個流程,希望各位大大們能提供給我些意見幫忙解決這問題
照理來說有濃度和吸光值應該就有RNA,而且值還不低,怎麼可能跑出來連simir和
dimer都沒有!?若是RT-PCR中間的過程有錯,那positive control怎麼可能出得來?
(我那組positive control的RNA是拿我以前惟一一次抽出來而且跑得出來的同種細胞
的RNA來轉, cDNA的則是拿別人跑過PCR確定出得來的來P)
我已經快沒辦法可想了.....
--
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◆ From: 219.70.125.197
1F：推 ericial:你的第一步好奇怪 細胞加完TRIZOL後需要離心嗎? 11/18 00:34
2F：→ ericial:我加完trizol後會靜置,然後加chloroform做你後面的步驟 11/18 00:35
3F：→ ericial:你chloroform加了以後可以擺約10分鐘 等分層出現後再離心 11/18 00:38
4F：→ ericial:然後你的isopropanol體積也不太對 至少要500ul的體積 11/18 00:42
5F：→ ericial:如果你的trizol是1ml:chloroform 200ul:isopropanol 500ul 11/18 00:43
6F：→ soom:先跑膠看看抽出來的RNA品質如何..有沒有兩條明顯的亮帶 11/18 01:08
7F：推 reinherd:你260/280多少？ 有沒有看260/230 另外就是第一步有問題 11/18 06:30
8F：推 ookubo:Primer OK嗎? or RNA降解掉了，260有值只能說是有核甘酸啊 11/18 08:42
9F：→ radan:260/280:1.95 260/230:2.03 我RNA是測完馬上轉RT的 11/18 09:20
10F：→ radan:應該不可能置冰上五分鐘內降解光，primer的話我control組 11/18 09:21
11F：→ radan:都有轉出來band而且很亮啊,只有sample組一片乾淨 11/18 09:22
12F：→ radan:而且我做了一組negative control,cDNA用水代替,跑出來跟我 11/18 09:23
13F：→ radan:跟我sample組一樣乾淨 11/18 09:23
14F：推 icome:我猜是都降解光了 最好全程冰上操作 我之前也搞很久才做出來 11/18 14:50
15F：→ icome:加完trizol離心是多餘的 細胞前一天換medium mRNA量會比較多 11/18 14:52
16F：→ icome:RT過程 如果可以 用2X以上反應(體積x2) 效果會比較好 11/18 14:54
17F：→ radan:從我測完吸光值到放進去轉RT才5分鐘而且是冰上,不可能解光吧 11/18 23:45
18F：推 ericial:還是建議你跑個RNA電泳 看看品質 感覺你的RNA可能斷光光 11/19 00:44
19F：→ ericial:斷光光的RNA一樣還是有吸光值 但是那個"質"就不一樣了 11/19 00:45
20F：→ ericial:而且你還用oligo dT去drive RT反應 斷光光的話根本做不出 11/19 00:48
21F：→ ericial:完整的cDNA pcr更遑論是夾出你要的片段了 11/19 00:49
22F：→ ericial:一邊設計pcr片段不會設計在尾端附近 11/19 00:51
23F：→ ericial:這可能是你怎麼跑都跑不出來目標片段的原因 參考一下吧 11/19 00:51
24F：推 icome:RNA無時無刻都在逐漸降解 從你抽取的過程就開始了 11/19 14:45
25F：→ icome:所以動作不夠快建議放冰上 放在室溫不會比較好 11/19 14:47
26F：→ datro:negative control應該用 沒轉RT的RNA才對 你的tip是專用的? 11/20 16:10
27F：→ datro:isopronal 通常是1:1體積加入 11/20 16:12
28F：推 blueashin:建議RNA跑膠確認順便看看有沒有DNA contaimination 01/06 10:11
29F：→ blueashin:另外你的primer長度多少?太長或太短都會造成專一性不好 01/06 10:12
30F：→ blueashin:或者dimer情況太嚴重 也是有可能,順道一提 01/06 10:13
31F：→ blueashin:如果只是一般RT-PCR還適用AMV吧M-MLV效率有比較差一些 01/06 10:13
32F：推 blueashin:這種基礎實驗的問題反而是最難抓的,祝好運喔 01/06 10:15