作者radan (为了部落!)
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标题[求救] RT-PCR出不来
时间Wed Nov 18 00:09:34 2009
小弟我是用Trizol抽cell line的RNA
目前遇到的困难是抽出来去测RNA浓度和260/280的值都不错
但是RT-PCR之後跑B2M却没东西,我有拿之前转得出来的RNA当positive control
测过RT,PCR则再拿这个positive control转完的cDNA加上别人跑过确定有东西的
cDNA来当两组positive control,最後结果这两组都有东西,但我的sample还是
连个鬼影子都没有,请问有大大知道到底是怎麽回事了吗?
底下附上我整个实验流程:
cell line:HepG2
-> 10cm dish cell + 1ml trizol
-> 4'C 12000rpm 10mins
-> 取上清液,室温5mins,+200ul chloroform 轻摇15 secs,室温3 mins
-> 4'C 12000rpm 10mins
-> 取上清液,+200ul isopropanol,室温5 mins
-> 4'C 12000rpm 10mins
-> 吸掉液体,+1ml 75% Ethanol wash pallete
-> 4'c 9000rpm 10mins
-> 去除Ethanol,将pallete air dry
-> +DEPC水20ul,测RNA浓度
-> Hep G2 : 2859.6ng/ul 260/280:1.95 260/230:2.03
-> RT步骤:DEPC水+dNTP+oligo dT+RNA=13ul
->65'C 5mins , 4'C 1mins , +5X buffer 4ul和0.1M DTT 2ul
->37'C 5mins , +1ul MMLV
->37'C 50 mins , 70'C 15mins
-> PCR步骤:DEPC水39.5ul+dNTP2ul+10X buffer 2ul+primer 2ul+cDNA2ul+Tag0.5
ul
->95'C 30secs , 58'C(B2M primer)30secs , 72'C 30secs , 35 cycle
72'C 10mins
-> 8ul产物跑胶
以上就是我整个流程,希望各位大大们能提供给我些意见帮忙解决这问题
照理来说有浓度和吸光值应该就有RNA,而且值还不低,怎麽可能跑出来连simir和
dimer都没有!?若是RT-PCR中间的过程有错,那positive control怎麽可能出得来?
(我那组positive control的RNA是拿我以前惟一一次抽出来而且跑得出来的同种细胞
的RNA来转, cDNA的则是拿别人跑过PCR确定出得来的来P)
我已经快没办法可想了.....
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 219.70.125.197
1F：推 ericial:你的第一步好奇怪 细胞加完TRIZOL後需要离心吗? 11/18 00:34
2F：→ ericial:我加完trizol後会静置,然後加chloroform做你後面的步骤 11/18 00:35
3F：→ ericial:你chloroform加了以後可以摆约10分钟 等分层出现後再离心 11/18 00:38
4F：→ ericial:然後你的isopropanol体积也不太对 至少要500ul的体积 11/18 00:42
5F：→ ericial:如果你的trizol是1ml:chloroform 200ul:isopropanol 500ul 11/18 00:43
6F：→ soom:先跑胶看看抽出来的RNA品质如何..有没有两条明显的亮带 11/18 01:08
7F：推 reinherd:你260/280多少？ 有没有看260/230 另外就是第一步有问题 11/18 06:30
8F：推 ookubo:Primer OK吗? or RNA降解掉了，260有值只能说是有核甘酸啊 11/18 08:42
9F：→ radan:260/280:1.95 260/230:2.03 我RNA是测完马上转RT的 11/18 09:20
10F：→ radan:应该不可能置冰上五分钟内降解光，primer的话我control组 11/18 09:21
11F：→ radan:都有转出来band而且很亮啊,只有sample组一片乾净 11/18 09:22
12F：→ radan:而且我做了一组negative control,cDNA用水代替,跑出来跟我 11/18 09:23
13F：→ radan:跟我sample组一样乾净 11/18 09:23
14F：推 icome:我猜是都降解光了 最好全程冰上操作 我之前也搞很久才做出来 11/18 14:50
15F：→ icome:加完trizol离心是多余的 细胞前一天换medium mRNA量会比较多 11/18 14:52
16F：→ icome:RT过程 如果可以 用2X以上反应(体积x2) 效果会比较好 11/18 14:54
17F：→ radan:从我测完吸光值到放进去转RT才5分钟而且是冰上,不可能解光吧 11/18 23:45
18F：推 ericial:还是建议你跑个RNA电泳 看看品质 感觉你的RNA可能断光光 11/19 00:44
19F：→ ericial:断光光的RNA一样还是有吸光值 但是那个"质"就不一样了 11/19 00:45
20F：→ ericial:而且你还用oligo dT去drive RT反应 断光光的话根本做不出 11/19 00:48
21F：→ ericial:完整的cDNA pcr更遑论是夹出你要的片段了 11/19 00:49
22F：→ ericial:一边设计pcr片段不会设计在尾端附近 11/19 00:51
23F：→ ericial:这可能是你怎麽跑都跑不出来目标片段的原因 参考一下吧 11/19 00:51
24F：推 icome:RNA无时无刻都在逐渐降解 从你抽取的过程就开始了 11/19 14:45
25F：→ icome:所以动作不够快建议放冰上 放在室温不会比较好 11/19 14:47
26F：→ datro:negative control应该用 没转RT的RNA才对 你的tip是专用的? 11/20 16:10
27F：→ datro:isopronal 通常是1:1体积加入 11/20 16:12
28F：推 blueashin:建议RNA跑胶确认顺便看看有没有DNA contaimination 01/06 10:11
29F：→ blueashin:另外你的primer长度多少?太长或太短都会造成专一性不好 01/06 10:12
30F：→ blueashin:或者dimer情况太严重 也是有可能,顺道一提 01/06 10:13
31F：→ blueashin:如果只是一般RT-PCR还适用AMV吧M-MLV效率有比较差一些 01/06 10:13
32F：推 blueashin:这种基础实验的问题反而是最难抓的,祝好运喔 01/06 10:15