作者relaxsleep (火球連發~)
看板Biotech
標題[求救] TA cloning
時間Sun Nov 15 15:14:28 2009
請問各位高手
我要把一段PCR產物(2.4K)放到pDrive cloning Vector
先使用TAKARA LA Taq獲得2.4 kb 的產物,電泳切膠,
再使用BioKit clean/Gel Etraction Kit回溶膠體 最後用水回溶
然後使用QIAGEN PCR Cloning KIT
pDrive cloning vector 1ul
PCR product 4ul
ligation master mix 2X 5ul
-----------------------------
10ul
放4度冰箱overnight
再使用益生的勝任細胞YE607去做轉殖
冰上 5 min
42度 45 sec
冰上 5 min
再去塗plate (LB-amp)藍白篩選
隔天長出的大部分是藍色的4~5顆 白色只有一顆
經抽質體後質體大小約在2 kb
BamHI XhoI 截切後出現3條片段約 2.1kb 3.3kb 3.8kb
與預期的3.8kb 2.4kb不同
請問是哪出了問題? ligation在16度會比較好嗎?
謝謝!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.109
1F：→ sunlittle:vector:insert比例不對? 11/15 17:03
2F：→ relaxsleep:我照他protocal寫加1~4ul 想說應該也沒差成這樣吧@@ 11/15 17:14
3F：推 conective:A tailing? 11/15 19:28
4F：→ bee921:應該要像一樓說的那樣吧! Insert的使用濃度 11/15 19:29
5F：推 conective:喔 用LA tag做就是 ligation 沒有用過4度C 是建議的嗎 11/15 19:31
6F：推 enisx:兩個問題: 1.ligation用4度有點怪~我都用16度或直接室溫 11/15 20:27
7F：→ enisx:2. heat shock完放完冰上,有要加medium長20分嗎? 11/15 20:29
8F：推 liuse:commercial competent cell可不用recovery 11/15 20:39
9F：推 silverberry:建議 PCR 如果是 single band 就直接用 clean up 11/15 20:57
10F：→ silverberry:因為 A tail 用 gel extraction 很容易掉 11/15 20:58
11F：→ silverberry:或是三樓說的做 A-tailing 11/15 20:58
12F：→ relaxsleep:他建議溫度寫4~16度都可以, LA Taq產物就是A tail了 11/15 21:26
13F：→ relaxsleep:他不是single band所以要用沏膠的 11/15 21:28
14F：→ relaxsleep:恩 這是commercial competent cell 不用recovery 11/15 21:29
15F：→ fungihsu:建議gel extraction之後再做加A tail的那一步 11/16 00:55
16F：→ fungihsu:還有TA cloning應該可以在室溫放5 mins ligation 11/16 00:56
17F：推 conective:同意樓上的看法 膠體純化之後再A tailing試試 11/16 01:08
18F：→ relaxsleep:謝謝 我試看看~ 11/18 15:58