作者relaxsleep (火球连发~)
看板Biotech
标题[求救] TA cloning
时间Sun Nov 15 15:14:28 2009
请问各位高手
我要把一段PCR产物(2.4K)放到pDrive cloning Vector
先使用TAKARA LA Taq获得2.4 kb 的产物,电泳切胶,
再使用BioKit clean/Gel Etraction Kit回溶胶体 最後用水回溶
然後使用QIAGEN PCR Cloning KIT
pDrive cloning vector 1ul
PCR product 4ul
ligation master mix 2X 5ul
-----------------------------
10ul
放4度冰箱overnight
再使用益生的胜任细胞YE607去做转殖
冰上 5 min
42度 45 sec
冰上 5 min
再去涂plate (LB-amp)蓝白筛选
隔天长出的大部分是蓝色的4~5颗 白色只有一颗
经抽质体後质体大小约在2 kb
BamHI XhoI 截切後出现3条片段约 2.1kb 3.3kb 3.8kb
与预期的3.8kb 2.4kb不同
请问是哪出了问题? ligation在16度会比较好吗?
谢谢!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.35.109
1F：→ sunlittle:vector:insert比例不对? 11/15 17:03
2F：→ relaxsleep:我照他protocal写加1~4ul 想说应该也没差成这样吧@@ 11/15 17:14
3F：推 conective:A tailing? 11/15 19:28
4F：→ bee921:应该要像一楼说的那样吧! Insert的使用浓度 11/15 19:29
5F：推 conective:喔 用LA tag做就是 ligation 没有用过4度C 是建议的吗 11/15 19:31
6F：推 enisx:两个问题: 1.ligation用4度有点怪~我都用16度或直接室温 11/15 20:27
7F：→ enisx:2. heat shock完放完冰上,有要加medium长20分吗? 11/15 20:29
8F：推 liuse:commercial competent cell可不用recovery 11/15 20:39
9F：推 silverberry:建议 PCR 如果是 single band 就直接用 clean up 11/15 20:57
10F：→ silverberry:因为 A tail 用 gel extraction 很容易掉 11/15 20:58
11F：→ silverberry:或是三楼说的做 A-tailing 11/15 20:58
12F：→ relaxsleep:他建议温度写4~16度都可以, LA Taq产物就是A tail了 11/15 21:26
13F：→ relaxsleep:他不是single band所以要用沏胶的 11/15 21:28
14F：→ relaxsleep:恩 这是commercial competent cell 不用recovery 11/15 21:29
15F：→ fungihsu:建议gel extraction之後再做加A tail的那一步 11/16 00:55
16F：→ fungihsu:还有TA cloning应该可以在室温放5 mins ligation 11/16 00:56
17F：推 conective:同意楼上的看法 胶体纯化之後再A tailing试试 11/16 01:08
18F：→ relaxsleep:谢谢 我试看看~ 11/18 15:58