※ 引述《liuse (充實自己，提昇自己)》之銘言： : ※ 引述《anchi (我家有隻可愛小都)》之銘言： : : 請問,使用lipofectamine做transfection : : 和用virus infection, 結果有何不同呢? : : 以下是我對此二方法的想法:(可能有很多錯誤請大家幫我指正) : : 假設我要將一個基因送入細胞株讓他表現. : : 一般可選擇可在真核細胞表現的vector(ex:pcDNA3)或 : : virus vector(ex:retrovirus vector)來攜帶此基因. : : 假設用pcDNA3攜帶此基因,再用lipofectamine送入細胞, : : 經過抗生素篩選一段時間,可得stable cell line. : : 如此可將此珠細胞冷凍保存,每次實驗需要再取出培養. : : 假設用virus vector攜帶此基因,則需先送入packaging cell, : : 製造virus, 再去infection 目標cell. : : 而被感染的細胞雖然會表現此基因,但細胞被病毒感染不久後也會死亡. : : 似乎無法穩定保存. : retrovirus 有個特性你忘記囉 : 去查查看 我個人非常喜歡Nolan Lab的Tutorial，是retrovirus創始老店 http://www.stanford.edu/group/nolan/tutorials/tutorials.html 非常值得花一些時間研讀。 retrovirus本身只對分裂中的細胞有感染效果 lentivirus則是廣泛的對分裂、非分裂細胞都具有感染效果。 有些人會把AAV(adeno-associated virus)分類為non-integral viral system 轉染效率非常高，也就是形成episome的狀態，但是並不持久。 關鍵在於你所轉殖的基因是否嵌入宿主染色體。這也是病毒感染持久的原因。 當然最近也有non-viral genomic integration 大致上是利用玉米(maze)上面發現的transposon這個玩意來做基因跳轉。 : 這樣你就會知道用virus infection的方式是可以穩定保存的 : 且花費的時間比用一般vector送進去挑stable clone來的短 : 所以不用再從package開始 : : 每次需要此細胞時須從vector送入packaging cell步驟開始... : : (好像沒看過直接用lipofectamine直接把virus plasmid送進目標細胞株,why?) virus所包裹的plasmid就是你一開始在packaging cell line放入的。 一個病毒的內容包含gag, pol, env三個蛋白，以及內容物， 仔細看map會發現你的interested gene兩端會有LTR(long terminal repeat) 那就是嵌入宿主基因的位置。 : : 這樣看起來好像使用一般真核細胞表現vector的方法比較簡單也比較能保存. : : 但是virus infection卻也是實驗是很普遍的方法. : : 請問大家這兩種方法transfection的結果差異或優缺點在哪裡呢? : episome: : 簡單快速方便，一般P1 lab就可操作。缺點是不同cell line transfection efficiency : 會有很大差異，像一些難搞的cell line (ex:HepG2)就算用萬惡的(價格上) : lipofectamine2000 效率也不大好 : virus infection: : 需要P2 lab才能操作(除非你偷做)，優點就是efficiency極好(MOI可以控制)，個人 : 推薦XD，至於你問的why那個問題，你去翻翻拿來做virus的plasmid裡面的map就知道 : 原因 : 歡迎大家分享心得和補完 : : 不好意思若我有些觀念錯誤請大家幫忙指正,謝謝! -- 宮﨑あおい命 http://photo.xuite.net/aceliang/121655/22.jpg --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.136.122.81