※ 引述《katty7389 (被風吹跑了~)》之銘言： : 大家好我是做western blotting的新手 : 最近實驗遇到瓶頸.想請大家幫忙 : 最近我在做KB跟L30 protein的表現 : 可是發現每次壓出來的internal control都不均勻 : (我有分fraction, cytoplasm是壓b-tubulin. nucleus是壓lamin B) : 我猜想幾個可能造成的原因 : 1.收細胞時,medium去除不乾淨 影響定量的結果 : 2.收細胞時 兩個細胞收的量不太一樣 影響定量結果 : 3.因為我把sample跟sample buffer加在一起之後去加熱.在loading到SDS-PAGE : 時發現體積會比原本兩者混在一起的體積還少.我覺得自己使用pipette的技術 : 沒有問題.我在想會不會是這個環節有問題 loading前用小烏龜稍微離心一下即可，internal control不均勻應該不是這個問題 : 因為只是猜測 不確定是哪邊出了問題 : 不過因為問題沒有解決 我有點害怕進行下一個實驗 所以想請大家幫我看看 : 這邊附上我收細胞到loading sample的流程 請大家幫我指正 : １。用trypsin打下細胞。離心１２０００rpm 去除medium再用PBS wash一次 : ２。離心　去除PBS : 3.用０.4M LYSIS buffer I與cell pellet mix : ４。on ice 15 min : 5.加入10%np40 votex後離心13000rpm 取上清液即為cytoplasmic extract : 6.加入lysis buffer II與cell pellet mix : ７。１５分鐘內　約每１分鐘vortex　１０秒 : ８。離心13000rpm 取上清液即為nucleus extract : 9.將取得的sample做定量 : １０。定量的結果假設為２.４１μg/μl,我每個well想loading 40μg.就加 : １６。５μl的sample與４μl　６x的sample buffer混勻(無論多少sample : 　　 : 　　　都加４μl的sample buffer)　 這裡有補水至相同體積吧？ : 11.100度煮protein 10分鐘 : １２。loading sample 定量時的標準曲線的R square是否大於0.995?是否有blank? : 有錯麻煩大家指正　謝謝 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.253.186 ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.186 (11/10 11:48)