※ 引述《katty7389 (被风吹跑了~)》之铭言： : 大家好我是做western blotting的新手 : 最近实验遇到瓶颈.想请大家帮忙 : 最近我在做KB跟L30 protein的表现 : 可是发现每次压出来的internal control都不均匀 : (我有分fraction, cytoplasm是压b-tubulin. nucleus是压lamin B) : 我猜想几个可能造成的原因 : 1.收细胞时,medium去除不乾净 影响定量的结果 : 2.收细胞时 两个细胞收的量不太一样 影响定量结果 : 3.因为我把sample跟sample buffer加在一起之後去加热.在loading到SDS-PAGE : 时发现体积会比原本两者混在一起的体积还少.我觉得自己使用pipette的技术 : 没有问题.我在想会不会是这个环节有问题 loading前用小乌龟稍微离心一下即可，internal control不均匀应该不是这个问题 : 因为只是猜测 不确定是哪边出了问题 : 不过因为问题没有解决 我有点害怕进行下一个实验 所以想请大家帮我看看 : 这边附上我收细胞到loading sample的流程 请大家帮我指正 : １。用trypsin打下细胞。离心１２０００rpm 去除medium再用PBS wash一次 : ２。离心　去除PBS : 3.用０.4M LYSIS buffer I与cell pellet mix : ４。on ice 15 min : 5.加入10%np40 votex後离心13000rpm 取上清液即为cytoplasmic extract : 6.加入lysis buffer II与cell pellet mix : ７。１５分钟内　约每１分钟vortex　１０秒 : ８。离心13000rpm 取上清液即为nucleus extract : 9.将取得的sample做定量 : １０。定量的结果假设为２.４１μg/μl,我每个well想loading 40μg.就加 : １６。５μl的sample与４μl　６x的sample buffer混匀(无论多少sample : 　　 : 　　　都加４μl的sample buffer)　 这里有补水至相同体积吧？ : 11.100度煮protein 10分钟 : １２。loading sample 定量时的标准曲线的R square是否大於0.995?是否有blank? : 有错麻烦大家指正　谢谢 --

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