作者kg9101266 (Chin)
看板Biotech
標題[求救] 新手想請問關於SDS-PAGE的問題
時間Sun Nov 8 11:37:13 2009
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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我是做10%gel 0.75尺寸的膠
sample 和 2X sample buffer 是1:1 然後會用1X sample buffer去補到同體積(補到24ul)
(2Xsample buffer: sample buffer 95ul + BME 5ul
1X : 2Xsample buffer 50ul + MQwater 50ul)
Q1
看BIO-RAD說明書上寫
10WELL的一個WELL可以low33ul體積
我一個sample需要low進well的量只有24ul
可是不管我怎麼小心、緩慢的low
還是會滿出來
可以很明顯看到淡藍色沿著well的"凹"字底部溢出道"凹"字兩個高點
我是拿20ul的pipement轉到12分兩次low
通常要low第二次時，就感覺已經快滿出來了
觀察sample的沉降，覺得還好，也是會沉下去
但就不會像mark一樣完全沉在well底部變成一條線
我老闆說我可能low太快，把sample衝上去，或是sample buffer配不準
但sample buffer配法就如同第一段所寫
low的速度也確實很緩慢了
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Q2
想請問大家是怎麼配膠的?
我自己的配法是照我老闆所說
配方都加到15ml管後，VOTEX約10秒
倒進去玻璃內
可是有同事跟我說votex會讓膠的結構被破壞
跑出來的band會扭曲，不會是一直線
ex放大圖: 扭--^---^^- 直---------
我自己在跑，明明做法都一樣，但有時候跑出來是直的，有時候卻會是扭的
然後，跑的時候扭，壓出來也是扭的>"<
我們家跑上膠是固定電流0.03A，下膠是固定電流0.06A
但是常常會到達最高電壓250V
我同事說我們家跑的電壓太大@@"
所以才跑不漂亮
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我以前從未跑過western
最近跑過幾次，都有一些疑問，很希望可以把膠跑得漂亮
想請各位前輩幫忙指點一下 十分感激
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.40.219.15
1F：推 leoblack:load sample前你會沖洗well嘛? 11/08 12:08
2F：推 tsubasawolfy:vortex會破壞結構XDDD 網狀結構是倒下去才慢慢形成 11/08 12:24
3F：→ tsubasawolfy:的吧? 15cc的配到10cc以上難vortex 可以改用50cc 11/08 12:24
4F：→ tsubasawolfy:震個1.2下均勻就好 10秒會有很多泡泡吧? 11/08 12:25
5F：推 loham:dye 加多一點,讓sample重一些好沉,電壓確實太大,要不然就放 11/08 12:34
6F：→ loham:冰上跑,電壓這麼大會很燙,電壓大也會扭 11/08 12:35
7F：→ Anvec:用尺量一下齒槽大小換算一下體積 就可以猜可以 load 多少啦 11/08 12:56
8F：→ Anvec:不過要估少一點 0.75mm 膠片 我手殘 我都只會 load 20ul 11/08 12:57
9F：→ Anvec:電壓太高會過熱 膠的孔洞會不均勻 就會歪歪扭扭 11/08 12:59
10F：→ Anvec:除非有 cooler 或是丟cold room 11/08 13:00
11F：→ Anvec:配 SDS-PAGE 用 stir 就好 用 Vortex 會產生氣泡 很麻煩 11/08 13:01
12F：→ Anvec:體積少的時候用 pipette 也可以:P 11/08 13:02
13F：推 DFS:我用離心管(回收)配膠 蓋上後不搖只用手旋轉後就可鑄膠了 11/08 14:03
14F：→ DFS:另外loading量.75我都只load 2~4uL 從未load到滿過... 11/08 14:04
15F：→ DFS:sample的蛋白量就要算得很精準 這樣跑出來的結果很漂亮 11/08 14:05
16F：→ DFS:跑膠時我都定電壓 上膠60~70V下膠95~110V只有Transfer時才設A 11/08 14:08
17F：→ DFS:不過.75的gel因為loading量太少 我都改1.0 or 1.5 11/08 14:09
18F：→ DFS:這樣sample量就可以拉高不少,但最多也只load到30uL 11/08 14:10
19F：→ kg9101266:下膠凝固後要做上膠之前和上膠拔掉齒梳後 我都會用 11/09 00:40
20F：→ kg9101266:running buffer 沖洗3次 11/09 00:40
21F：→ kg9101266:用vortex的確很容易起泡，我會偷偷用drop把泡泡吸走再倒 11/09 00:46
22F：→ kg9101266:因為我們的sample濃度不高 所以low的體積就...而且很珍 11/09 00:50
23F：→ kg9101266:貴 所以暫時無法再取得。想請問一下，如果不加1X dye補 11/09 00:51
24F：→ kg9101266:成同體積 跑出來會很醜嗎? 11/09 00:53
25F：→ kg9101266:loham大大，請問dye的增加是指?2x dye和sample比例不是 11/09 00:55
26F：→ kg9101266:一定要1:1嗎? 抱歉，我對於這方面真的很不熟...>"< 11/09 00:55
27F：→ kg9101266:謝謝樓上各位前輩這麼熱心回答 受益良多 >"< 11/09 00:56
28F：→ kg9101266:DFS大 我們剛好跟您家相反呢...跑膠時固定電流 TRANSFER 11/09 00:59
29F：→ kg9101266:時則是固定電壓(15V) 一次只transfer一片GEL 11/09 01:01
30F：推 toocool5941:sample buffer + sample 可 = 1:2 = 5ul + 10ul 11/09 01:20
31F：→ toocool5941:蛋白濃度若太低可濃縮 11/09 01:21
32F：→ toocool5941:配膠千萬別vortex，氣泡的確會破壞結構和影響凝膠 11/09 01:22
33F：→ toocool5941:固定電壓或電流都，但固定電壓比較保險。電流較多變因 11/09 01:25
34F：推 loham:我的意思是dye在sample比例增加,樓上你是不是打錯啊? 這樣 11/09 01:53
35F：→ loham:sample buffer(dye)更稀耶? 11/09 01:54
36F：→ loham:怕體積太大就用4X dye阿~ 11/09 01:55
37F：推 loham:我們家學長是管耗材的,他都是4X dye當2X用,load起來超沉的 11/09 02:01
38F：→ loham:據說增加sample的鹽類也會比較重,可是這我沒試過,我同學是把 11/09 02:03
39F：→ loham:補體積的DDW用PBS取代,聽說會比較沉,這個我也沒試過 11/09 02:05
40F：推 loham:電流電壓其實只要懂原理,國中理化公式代一代,怎麼跑怎麼OK的 11/09 02:09
41F：推 toocool5941:我意指每well容積只要15ul就很足夠了。 11/09 02:10
42F：→ loham:不管是定電壓或定電流,注意溫度,溫度影響蛋白外也影響電阻 11/09 02:11
43F：→ toocool5941:若用PBS，鹽類會增加電阻，lane的邊邊容易拖尾 11/09 02:12
44F：→ loham:影響電阻,電流電壓就會變,runing的狀態怎樣就可以體會了 11/09 02:13
45F：→ loham:所以增加鹽類不是好方法阿~~ 受教授教! 還好沒試XD 11/09 02:14
46F：推 toocool5941:跑膠時固定電壓或電流影響較小，但transfer時- 11/09 02:17
47F：→ toocool5941:固定電流需注意每張紙大小必須裁的剛剛好，否則電流- 11/09 02:18
48F：→ toocool5941:往電阻比較小的低方去，則影響效率 11/09 02:18
49F：推 loham:那要看機器,我用過超多牌子的,現在實驗室用的Hofer最容易冒 11/09 02:19
50F：→ loham:煙,電壓高的時候不放冰包都超燙,膠會變形orz 用來用去台製 11/09 02:21
51F：→ loham:東生便宜又好用 11/09 02:22
52F：→ alulu:load快一點看看 有時候太慢 擴散開來 反而停在很高的地方 11/09 09:40
53F：→ DFS:我也用hofer跑膠and Transfer 整個system就放4度C冰箱內跑 11/09 10:30
54F：→ Anvec:因為 Hofer 的膠比較大片 電阻相對就高呀 :D 不要加蓋就好了 11/09 11:09
55F：→ Anvec:但是bio-rad 的系統好像一定要加蓋 太久沒用 忘了 11/09 11:10
56F：→ Anvec:不加蓋可以降一點點溫度 11/09 11:11
57F：推 cyin592:東生好用+1 塞冰塊下去 400 mA 1h 水都還是冷的 11/10 10:38
58F：→ cyin592:有種專門load樣品的tip 前端很細 load大體積 較不會溢出來 11/10 10:41
59F：→ cyin592:上面400 mA 指的是transfer時 XD 11/10 10:42
60F：→ kg9101266:謝謝大家的意見 感覺好有收穫 再次感謝喔^_^ 11/10 21:50